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腺苷酸活化蛋白激酶α在高血糖大鼠急性創(chuàng)面再上皮化過程中的表達(dá)

2021-05-08 06:38:02王治兵徐秋燕王寶宏張艷冰曹露瑩侯紹章董儉達(dá)
關(guān)鍵詞:血糖實(shí)驗(yàn)

王治兵,徐秋燕,王寶宏,張艷冰,曹露瑩,馬 凱,侯紹章,董儉達(dá)

(1.寧夏賀蘭縣人民醫(yī)院,賀蘭 750200;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院,銀川 750004;3.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系,銀川 750004)

中國(guó)是目前糖尿病患者最多的國(guó)家[1]。我國(guó)因慢性創(chuàng)面住院的患者,其中糖尿病相關(guān)創(chuàng)面達(dá)32.6%[2]。早期發(fā)現(xiàn)糖尿病慢性難愈創(chuàng)面的危險(xiǎn)因素,積極干預(yù)急性創(chuàng)面延遲愈合(delayed wound healing,DWH)的問題,對(duì)預(yù)防糖尿病足等慢性難愈性創(chuàng)面的發(fā)生具有關(guān)鍵作用[3-4]。再上皮化障礙(re-epithelialization disorder,RED)是DWH的關(guān)鍵事件,與DWH惡化及慢性難愈性創(chuàng)面發(fā)生密切相關(guān)[3-4]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是細(xì)胞內(nèi)重要的能量感受器,在糖尿病發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用[5]。有研究[6]發(fā)現(xiàn)AMPK的激活劑二甲雙胍對(duì)糖尿病創(chuàng)面愈合有促進(jìn)作用,其機(jī)制尚不清楚。本研究通過建立高血糖大鼠模型,制備大鼠皮膚急性創(chuàng)面,利用二甲雙胍局部處理創(chuàng)面,動(dòng)態(tài)觀察AMPKα其創(chuàng)面再上皮化(re-epithelialization,RE)區(qū)角質(zhì)形成細(xì)胞(KCs)中的表達(dá),為糖尿病創(chuàng)面DWH的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)線索,為糖尿病創(chuàng)面臨床治療提供潛在的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 材料及儀器

雄性Sprague Dawley(SD)大鼠30只,體質(zhì)量150~160g,由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[Ⅰ級(jí)動(dòng)物,合格證編號(hào)SCXK(N)2015-0001]。鏈脲佐菌素(STZ,Sigma公司,美國(guó)),鹽酸二甲雙胍腸溶片(批號(hào):148880484;天安藥業(yè)股份有限公司),血糖測(cè)試儀(博仕瓏,GLM-7911W,中國(guó)),皮膚取樣器(皮膚環(huán)鉆,直徑5 mm,Acuderm公司,美國(guó)),小鼠單克隆IgG2a(kappa輕鏈)AMPKα1/2抗體(克隆號(hào):D-6;Santa Cruz公司,美國(guó)),ABC試劑盒為VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit(Peroxidase,Mouse IgG)(PK-6102),ImmPACT DABPeroxidase(HRP)Substrate(SK-4105),均購(gòu)自美國(guó)Vector Laboratories公司,蘇木素-伊紅試劑(DH0006,Leagene公司,中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和高血糖大鼠制備 實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常血糖對(duì)照組(NC)、高血糖組(DC)、高血糖二甲雙胍干預(yù)組(DM),每組10例。飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,溫度22℃,明暗周期12 h∶12 h,在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)并適應(yīng)1周。血糖檢測(cè)前,禁食12~24 h,尾靜脈取血備檢。以pH為4.6的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制10%STZ,以65 mg·kg-1劑量腹腔注射,注射后每天觀察并測(cè)量大鼠體質(zhì)量、食入量、飲水、毛色及活動(dòng)情況,繼續(xù)飼養(yǎng)1周,測(cè)定尾靜脈血糖。血糖檢測(cè)前大鼠尾靜脈取血,血糖計(jì)檢測(cè),以空腹血糖>16.7 mmol·L-1作為高血糖狀態(tài)的判定標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.2.2 創(chuàng)面制備、處理及標(biāo)本收集 10%水合氯醛腹腔注射(0.3 mL/100 g)予以麻醉,背部備皮,常規(guī)消毒,利用王寶宏發(fā)明并制作的動(dòng)物皮膚創(chuàng)面制備裝置(專利證書號(hào):10032087),在大鼠背部脊柱兩側(cè)制備4個(gè)兩兩對(duì)稱的5 mm全層皮膚創(chuàng)面模型[8]。無菌條件下,將二甲雙胍研磨至粉末,與醫(yī)用凡士林1∶2充分混勻,配為霜?jiǎng)?℃冰箱保存?zhèn)溆谩M組創(chuàng)面1 cm×1 cm區(qū)域涂抹二甲雙胍凡士林霜?jiǎng)?次/d。于實(shí)驗(yàn)第1、3、6、9、12天,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組麻醉2只大鼠,快速切取創(chuàng)面組織。收集創(chuàng)面周圍1 cm×1 cm區(qū)域皮膚全層創(chuàng)面組織,每組8個(gè)創(chuàng)面,創(chuàng)面旁放置比例尺并用相機(jī)拍照記錄,創(chuàng)面組織沿最大直徑切開,一半創(chuàng)面置于4%甲醛溶液中固定24 h,垂直放入包埋盒,組織梯度乙醇脫水過夜,浸蠟,石蠟包埋,連續(xù)切片10張(厚度4μm),另一半創(chuàng)面組織-80℃凍存。皮膚創(chuàng)面照片利用Photoshop軟件進(jìn)行傷口最大直徑測(cè)量。

1.2.3 蘇木素-伊紅染色(HE) 石蠟切片二甲苯脫蠟,梯度乙醇至水,蘇木精液染色室溫10 min,流水沖洗,1%鹽酸乙醇分化1~3 s,流水沖洗,自來水浸泡返藍(lán),0.5%伊紅液染色30~60 s,梯度乙醇浸泡,80%乙醇1~2 s,95%乙醇1~2 s,無水乙醇1~2 s,二甲苯10 min,中性樹膠封片。由Motic數(shù)字切片系統(tǒng)掃描保存為數(shù)字切片。

1.2.4 免疫組化染色 切片二甲苯脫蠟至水,0.01 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)微波加熱修復(fù)10 min,冷卻,3%H2O2室溫孵育10 min,PBS沖洗,10%山羊血清室溫封閉30 min,吸去,AMPKα1/2的一抗工作液4℃過夜,同時(shí)另一切片以PBS取代一抗4℃孵育過夜作為陰性對(duì)照;PBS沖洗,生物素化的山羊抗小鼠二抗室溫孵育30min,PBS沖洗,試劑盒A(1∶50)和B(1∶50)混合液(A:Avidin溶液;B:生物素化辣根過氧化物酶)室溫孵育30 min,PBS沖洗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹脂封片,由Motic數(shù)字切片系統(tǒng)掃描保存為數(shù)字切片。免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[9]:染色分為陽性和陰性兩種結(jié)果,以細(xì)胞胞膜和(或)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒狀著色判斷為陽性,以細(xì)胞胞膜和(或)胞質(zhì)內(nèi)無棕黃色顆粒狀著色判斷為陰性。AMPKα的陽性著色分布于細(xì)胞膜和(或)胞質(zhì)。

1.2.5 計(jì)量組織學(xué)分析方法 在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取每組大鼠4個(gè)不同創(chuàng)面的組織切片,利用采用Motic圖像軟件測(cè)量表皮傷口直徑、真皮傷口直徑[9]。表皮傷口直徑=兩側(cè)創(chuàng)緣再上皮化表皮之間區(qū)域的長(zhǎng)度。AMPKα染色結(jié)果的半定量檢測(cè)[9]:在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取每組大鼠4個(gè)不同創(chuàng)面的組織切片,鏡下區(qū)分創(chuàng)旁正常表皮區(qū)及RE區(qū),在以上區(qū)域分別隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(HPF)。利用Image J軟件,將AMPKα染色結(jié)果的掃描圖片從TIF格式轉(zhuǎn)為8-bit圖片,利用軟件中Threshold功能選定陽性區(qū)域,Threshold參數(shù)0.28~2.71,所有待檢圖片參數(shù)保持一致;隨后利用Image J軟件檢測(cè)平均OD值(陽性強(qiáng)度,OD值范圍:0~2.71)及陽性面積百分?jǐn)?shù)(陽性率,陽性區(qū)域占總檢測(cè)區(qū)域的百分比)檢測(cè),檢測(cè)3次,取平均值作為參考值。AMPKα平均陽性強(qiáng)度=AMPKα測(cè)量OD值/檢測(cè)區(qū)域總面積。分別檢測(cè)待測(cè)樣本每個(gè)HPF的AMPKα平均陽性強(qiáng)度,計(jì)算多個(gè)高倍視野平均陽性強(qiáng)度的均值作為本組樣本的測(cè)量參考值。AMPKα在RE區(qū)KCs細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平計(jì)算公式:AMPKα相對(duì)表達(dá)水平=AMPKα在RE區(qū)平均陽性強(qiáng)度(OD值)/AMPKα在對(duì)應(yīng)周邊正常表皮中的平均陽性強(qiáng)度(OD值)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析,方差不齊時(shí)用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn),P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量及血糖

實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體質(zhì)量及血糖差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。實(shí)驗(yàn)后(注射STZ 1周后),與NC組大鼠比較,DC組和DM組大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿及體質(zhì)量減輕,毛色無光澤,活動(dòng)度降低;與NC組比較,DC組和DM組大鼠體質(zhì)量均降低(P均<0.05);血糖方面,與NC組比較,DC組和DM組大鼠尾靜脈血糖均升高(P均<0.05);與DC組比較,DM組體質(zhì)量和血糖的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),見表1。

2.2 創(chuàng)面愈合過程的大體觀察

各組大鼠背部急性創(chuàng)面制備成功后,傷口形狀規(guī)則、圓形,直徑5 mm,創(chuàng)面清潔,創(chuàng)緣整齊,僅見極少量出血,無明顯滲出。實(shí)驗(yàn)第1天,肉眼觀察各組大鼠背部創(chuàng)面,傷口均呈較為規(guī)則的圓形,創(chuàng)緣周邊組織輕度發(fā)紅、腫脹并略微隆起,創(chuàng)腔內(nèi)可見少量血痂附著,未見明顯膿性滲出及新鮮出血。實(shí)驗(yàn)第3天,NC組大鼠傷口收縮減小,創(chuàng)緣整齊;DC組和DM組大鼠傷口肉眼觀察亦有收縮變小,與NC組大鼠比較,傷口收縮減小程度較小。實(shí)驗(yàn)第6天,NC組大鼠較之前傷口明顯收縮減小,甚至個(gè)別大鼠傷口已完全愈合;DC組和DM組大鼠傷口肉眼觀察亦有收縮變小。實(shí)驗(yàn)第9天,NC組大鼠創(chuàng)面均已完成愈合;DC組大鼠較之前傷口輕度收縮變小,尚未完全愈合;DM組大鼠較之前傷口明顯收縮變小,呈較規(guī)則點(diǎn)狀及小圓形,已基本完成愈合。實(shí)驗(yàn)第12天,NC組和DM組大鼠傷口均已完全愈合;DC組大鼠傷口明顯收縮變小,但尚未完全愈合,見圖1。

2.3 創(chuàng)面愈合的鏡下特征

實(shí)驗(yàn)第1天,由皮膚表層到皮下組織由上到下觀察,各組大鼠傷口開放,創(chuàng)底深達(dá)淺層皮下組織層(符合模型制備全層皮膚創(chuàng)面的要求)。實(shí)驗(yàn)第3天,各組大鼠傷口均顯示開放,創(chuàng)緣可見數(shù)量不一的再生性KCs細(xì)胞構(gòu)成的RE區(qū),傷口底部可見肉芽組織形成。伴隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間變化,各組大鼠鏡下傷口長(zhǎng)度呈變小的趨勢(shì),至實(shí)驗(yàn)第12天,僅DC組大鼠部分創(chuàng)面未完全愈合,其他組大鼠均已完全愈合,見圖2。鏡下表皮傷口長(zhǎng)度的測(cè)量結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)第3天,與NC組比較,DC組和DM組傷口均較大(P均<0.05);與DC組比較,DM組傷口較大(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)第6天,與NC組比較,DC組傷口較大(P<0.05),DM組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與DC組比較,DM組傷口較小(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)第9天,與NC組和DM組分別比較,DC組傷口較大(P均<0.05);NC組及DM組傷口已完成RE區(qū)KCs細(xì)胞完全覆蓋,完成RE過程。實(shí)驗(yàn)第12天,與NC組和DM組傷口分別比較,DC組較大(P均<0.05);DC組尚未完成RE區(qū)KCs細(xì)胞覆蓋,見表2。

表1 不同處理組大鼠體質(zhì)量和血糖檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

表1 不同處理組大鼠體質(zhì)量和血糖檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

與NC組比較*P<0.05。

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圖1 各組大鼠創(chuàng)面愈合過程大體圖

2.4 AMPKα的表達(dá)

2.4.1 AMPKα在各組大鼠皮膚組織中的表達(dá) AMPKα主要表達(dá)在表皮、毛囊、皮脂腺及淺層橫紋肌組織中,其中在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)最多。AMPKα在大鼠皮膚表皮各層細(xì)胞中表達(dá)不同,基底細(xì)胞顯示低表達(dá),棘層細(xì)胞低到中等強(qiáng)度表達(dá),顆粒層及角化層細(xì)胞高表達(dá)。為定位于胞質(zhì)和胞膜的棕黃色染色。AMPKα在大鼠正常表皮中的表達(dá),NC組OD值為(0.51±0.08)(n=40 HPF),DC組OD值為(0.53±0.08)(n=60 HPF),DM組OD值為(0.54±0.07)(n=60 HPF),與NC組比較,DC組和DM組表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),見圖3。

圖2 各組大鼠創(chuàng)面組織HE染色(箭頭:鏡下表皮創(chuàng)緣)

表2 各組大鼠鏡下表皮傷口長(zhǎng)度比較(±s,mm)

表2 各組大鼠鏡下表皮傷口長(zhǎng)度比較(±s,mm)

與同時(shí)間DC組比較*P<0.05。

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圖3 AMPKα的免疫組化染色(黑箭頭為創(chuàng)緣)

2.4.2 AMPKα在各組大鼠創(chuàng)面RE區(qū)KCs細(xì)胞中的表達(dá) AMPKα在NC組、DC組及DM組大鼠創(chuàng)面RE區(qū)KCs細(xì)胞中呈淡黃色或黃色低強(qiáng)度表達(dá)(圖3D~I(xiàn))。第6天和第12天,不同處理組大鼠RE區(qū)AMPKα表達(dá)OD值測(cè)量結(jié)果顯示:NC組、DC組和DM組RE區(qū)均低于其對(duì)應(yīng)周邊表皮組織(P均<0.05),見表3。

表3 不同處理組大鼠皮膚創(chuàng)面AMPKα表達(dá)的OD值測(cè)量結(jié)果比較(±s)

表3 不同處理組大鼠皮膚創(chuàng)面AMPKα表達(dá)的OD值測(cè)量結(jié)果比較(±s)

與對(duì)應(yīng)周邊表皮比較*P<0.05。

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2.4.3 AMPKα在各組大鼠創(chuàng)面RE區(qū)KCs細(xì)胞相對(duì)表達(dá)水平的比較 比較不同處理組大鼠RE區(qū)AMPKα的相對(duì)表達(dá)水平:第6天和第12天,NC組、DC組及DM組的三組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05);NC組與DC組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);與NC組比較,DM組均較低(P均<0.05);與DC組比較,DM組較低(P均<0.05),見圖4。

圖4 AMPKα在再上皮化角質(zhì)形成細(xì)胞相對(duì)表達(dá)水平比較

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),糖尿病創(chuàng)面難愈可能與創(chuàng)面高糖微環(huán)境,糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)增多以及活性氧(ROS)過度激活的損傷有關(guān)[10]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一種在進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶,廣泛參與對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪、糖和核苷酸代謝的調(diào)節(jié)[5]。AMPK是一個(gè)異三聚體結(jié)構(gòu),包含1個(gè)催化亞基α(α1和α2)及兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基β(β1和β2)及γ(γ1,γ2和γ3),β亞基連接α及γ亞基,γ亞基具有AMP和ATP的理論結(jié)合位點(diǎn)[5]。研究發(fā)現(xiàn)[11]AMPK能夠直接感知葡萄糖,通過溶酶體途徑磷酸化激活A(yù)MPK。目前AMPK在創(chuàng)面愈合過程中RE區(qū)的表達(dá)模式還不清楚。本研究通過建立高血糖大鼠急性皮膚創(chuàng)面模型,為AMPK參與調(diào)控創(chuàng)面修復(fù)的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DC組和DM組大鼠血糖均高于16.7 mmol·L-1,體質(zhì)量低于NC組大鼠,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。在創(chuàng)面愈合過程動(dòng)態(tài)觀察中發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)第6天NC組大鼠愈合明顯,未愈合區(qū)傷口規(guī)則,創(chuàng)面清潔;DC組大鼠雖有收縮變小,但創(chuàng)面缺損區(qū)面積較NC組大,傷口形狀欠規(guī)則,提示高血糖大鼠創(chuàng)面愈合不良,發(fā)生DWH。本實(shí)驗(yàn)的鏡下表皮傷口長(zhǎng)度測(cè)量結(jié)果也顯示,實(shí)驗(yàn)第3、第6、第9和第12天,DC組大鼠均大于NC組;實(shí)驗(yàn)第12天NC組大鼠傷口RE區(qū)已被再生表皮完全覆蓋,完成RE過程,但DC組大鼠仍有部分區(qū)域未完全愈合,RE區(qū)未完全被再生表皮覆蓋。以上結(jié)果證實(shí)高血糖大鼠創(chuàng)面出現(xiàn)DWH,并出現(xiàn)RED情況與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8],提示本研究的高血糖大鼠創(chuàng)面延遲愈合(DWH)模型制備成功。皮膚創(chuàng)面RE區(qū)的KCs細(xì)胞屬于上皮細(xì)胞,在創(chuàng)面修復(fù)過程中,再生的上皮細(xì)胞可以轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂性鲋澈鸵菩心芰Φ拈g質(zhì)樣細(xì)胞,其成熟上皮的標(biāo)記物(K10和CFTR等)或細(xì)胞間連接蛋白(E-cadherin及Zo-1等)出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)[9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在NC組、DC組及DM組大鼠中,伴隨創(chuàng)面愈合過程,RE區(qū)AMPKα均出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)低于周圍正常皮膚表皮,這與文獻(xiàn)報(bào)道[9]的成熟上皮標(biāo)記物及細(xì)胞間連接蛋白表達(dá)模式非常類似,提示AMPK可能是KCs細(xì)胞成熟分化的潛在標(biāo)記物,其下調(diào)表達(dá)可能參與了對(duì)其增殖和移行的促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還顯示,DC組大鼠皮膚表皮AMPK本底表達(dá)水平較正常血糖組高,提示高糖可能會(huì)誘導(dǎo)AMPK表達(dá)升高并參與對(duì)RE過程影響和調(diào)節(jié)。有研究[13]發(fā)現(xiàn),AMPK激活劑可以抑制體外培養(yǎng)的KCs細(xì)胞生長(zhǎng),提示AMPK介導(dǎo)的能量代謝途徑對(duì)KCs細(xì)胞有潛在影響。AMPK還可以被其上游鈣相關(guān)的激酶LKB1磷酸化激活,磷酸化激活的AMPK可以部分介導(dǎo)上皮細(xì)胞緊密連接的組裝和分解[14-15]。以上研究提示AMPK上調(diào)表達(dá)與上皮細(xì)胞的成熟分化正相關(guān),成熟分化的上皮細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)增殖和移行能力的降低。在創(chuàng)面愈合過程中,RE區(qū)KCs細(xì)胞E-cadherin可出現(xiàn)先下調(diào)表達(dá)情況[16],這一點(diǎn)與AMPK的表達(dá)模式也非常相似。因此,AMPK在RE區(qū)的下調(diào)表達(dá)可能有利于KCs細(xì)胞增殖和移行,促進(jìn)RE過程早期和中期快速覆蓋創(chuàng)面的過程;一旦RE過程完成,AMPK在再生的表皮中可能會(huì)逐步上調(diào)表達(dá),逐漸完成對(duì)表皮結(jié)構(gòu)和功能的重建和恢復(fù),當(dāng)然這還屬于科學(xué)假設(shè),需要未來的工作進(jìn)一步研究證實(shí)。

降糖藥二甲雙胍外用可以促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合過程[6,8,17],同時(shí)二甲雙胍是AMPK的激活劑已被證實(shí)[5];但二甲雙胍是否是通過影響AMPK表達(dá)參與創(chuàng)面修復(fù)的調(diào)節(jié),目前還不清楚。本實(shí)驗(yàn)中,我們利用二甲雙胍霜?jiǎng)┚植刻幚砀哐谴笫螅―M組)創(chuàng)面,結(jié)果顯示,在DM組大鼠創(chuàng)面愈合明顯好于DC組大鼠,并接近NC組的愈合情況。在本實(shí)驗(yàn)的第6、第9和第12天,DM組大鼠表皮傷口長(zhǎng)度小于高血糖組;實(shí)驗(yàn)第12天DM組大鼠傷口RE區(qū)已被再生KCs細(xì)胞完全覆蓋,完成RE過程。提示二甲雙胍促進(jìn)了高血糖大鼠創(chuàng)面愈合過程,改善了其DWH和RED問題,可能對(duì)RE過程具有一定的調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察了二甲雙胍處理的高血糖大鼠創(chuàng)面RE區(qū)AMPK的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)第6天及第12天,DM組大鼠RE區(qū)AMPK表達(dá)均低于NC組和DC組,提示AMPK的相對(duì)低表達(dá)對(duì)于創(chuàng)面愈合的RE過程具有潛在促進(jìn)作用,二甲雙胍促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合可能與改善RED有關(guān)。研究表明AMPK可能不單通過其磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[5],其本身的表達(dá)也會(huì)對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生影響,當(dāng)然具體機(jī)制闡明也一定需要結(jié)合未來對(duì)AMPK磷酸化情況研究進(jìn)一步證實(shí)。有研究發(fā)現(xiàn)AMPK可以抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、血管緊張素及醛固酮誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程,同時(shí)促進(jìn)間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(MET)[18]。還有研究發(fā)現(xiàn)AMPK可以被其上游鈣相關(guān)的激酶LKB1磷酸化激活,磷酸化激活的AMPK可以部分介導(dǎo)上皮細(xì)胞緊密連接的組裝和分解[14,19],提示AMPK參與對(duì)EMT/MET的復(fù)雜調(diào)節(jié)作用,這樣的情況在氣道[20]和消化道上皮[15]上也被驗(yàn)證。以上研究與本項(xiàng)目關(guān)注的皮膚表皮KCs細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似,提示AMPK對(duì)上皮細(xì)胞功能狀態(tài)的調(diào)控作用可能具有相對(duì)的廣泛性。高糖可引起皮膚KCs細(xì)胞AMPK表達(dá)升高,但AMPK激活劑卻可以下調(diào)其表達(dá),其中具體作用機(jī)制仍不清楚,需進(jìn)一步研究。

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