DRD2在RLS大鼠模型LPAG上的變化

張先元 陳強 章正祥 周會霞 邵敏峰 黃春華

不安腿綜合征（RLS）是一種嚴重影響生活的中樞神經系統疾病，最典型的癥狀是有強烈活動雙腿的愿望，還常伴有肢體麻木、疼痛等不適感。目前認為脊髓多巴胺能傳遞的減少可導致RLS［1］。臨床上使用多巴胺能拮抗劑可使病情加重，激動多巴胺D2受體（DRD2）、多巴胺D3受體（DRD3）可改善癥狀。研究發現中腦導水管周圍灰質（PAG）和防御行為、疼痛密切相關［2-4］。本研究旨在探索RLS大鼠模型上PAG多巴胺D2受體的變化。

1 材料與方法

1.1 組織來源 雄性SD大鼠隨機分成空白組（n=3）、假手術組（n=6）、模型組（n=6）。對右側A11進行藥物注射，第8天進行行為學錄制和腦組織取材［5］。

1.2 主要試劑 小鼠抗大鼠TH單克隆抗體（T1299），Sigma-Aldrich；兔抗大鼠D2多克隆抗體（324393），Calbiochem；山羊抗兔IgG/HRP 聚合物（PV-6001），北京中杉金橋生物技術有限公司；山羊抗小鼠IgG/HRP聚合物（PV-6002），北京中杉金橋生物技術有限公司；DAB（ZLI-9018），北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 儀器 冰凍切片機（HM 550），德國美康儀器設備有限公司；數字切片掃描儀（Pannoramic MIDI II），3DHISTECH。

1.4 免疫組化 （1）切片制備：根據《大鼠腦立體定位圖譜》（第6版）分別對A11、中腦導水管周圍灰質（PAG）進行定位。在-20℃的恒溫箱中連續切片，A11厚度為30 μm，每隔5張取1張，共6套，每套12～15張，PAG厚度40 μm，隔3張取1張，取3張切片，收集于0.01M PBS液中，于4℃保存。（2）免疫組化漂片法：吸干PBS液，3% H2O2室溫孵育15 min；PBS液搖床漂洗3 min，共3次；加入含有0.3% Triton X-100的PBST液孵育30 min；吸干PBST液，加一抗，4 ℃孵育過夜；PBS液搖床漂洗10 min，共3次；加入二抗聚合物，37℃孵育20 min；PBS液搖床漂洗10 min，共3次；DAB溶液現用現配，避光顯色5～10 min；PBS液搖床漂洗5 min，共3次；貼片，37 ℃烘干；85%、90%、95%、95%、100%、100%乙醇梯度脫水各2 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各透明2 min；中性樹膠封片。A11加小鼠抗大鼠TH單克隆抗體（1∶2000）和山羊抗小鼠IgG/HRP聚合物，PAG加兔抗大鼠D2多克隆抗體（1∶4000）和山羊抗兔IgG/HRP 聚合物。

1.5 圖片分析 （1）每只大鼠取第一和第四套A11切片進行染色。所有A11切片在同一物鏡（×4）下用顯微成像系統進行照片采集。剔除只含黑質、A13等部位的切片，每套最終取6張含A11部位的切片（以mt、fr及第三腦室等為參考標志），人工計數A11部位表達TH多巴胺神經元的數目，并分左右進行統計。（2）利用數字切片掃描儀對組織切片進行數字化掃描，以《大鼠腦立體定位圖譜》第6版為參考，對導水管周圍灰質外側（LPAG）放大40倍后選取一張圖像進行分析。人工計數多巴胺D2受體陽性表達的細胞數量，并分左右進行統計。單側A11多巴胺神經元數量=12張切片同側A11多巴胺神經元數量之和，毀損率=1-單側A11多巴胺神經元數量/空白組同側A11多巴胺神經元數量的均值，毀損率若為負數，則記為0，如果毀損組毀損率＜20%，假手術組≥20%，則予以剔除。其中1個假手術組樣本碎裂，1個假手術組樣本右側A11毀損率＞20%（同批次動物本研究團隊行A11毀損率檢測，大部分假手術組右側A11毀損率＜20%），兩個樣本均予以剔除，剩余13個樣本。模型組、假手術組各取3個樣本，與空白組匹配。

1.6 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件。計量資料符合正態分布，以（±s）表示，方差齊者采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，方差不齊者采用Games-Howell統計法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學及A11毀損結果 毀損組右側A11多巴胺神經元毀損率明顯高于對側和假手術組右側，差異均有統計學意義（P＜0.01），表明A11毀損是成功的，并且毀損一側A11多巴胺神經元的同時還會引起對側A11多巴胺神經元的減少。毀損組第3 h的爬籠時間高于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05），而其余時間段和指標均無明顯差異，表明在11∶00-12∶00時間段，毀損組的運動活性有所增高。

2.2 多巴胺D2受體陽性表達的細胞數量及比較 LPAG左側及右側中多巴胺D2受體陽性細胞組間均有明顯差異。見表1。免疫組化結果見圖1、2。

表1 LPAG中多巴胺D2受體陽性細胞數量的比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

指標部位 組別 n LPAG右側 左側DRD2 模型組 3 42.00±1.33 42.67±2.19假手術組 3 26.89±0.69# 26.78±0.51#正常組 3 33.33±7.94 33.11±6.29*F值 7.930 12.902 P值 0.021 0.007

圖1 -1空白組LPAG左側DRD2（×40）

圖1 -2假手術組LPAG左側DRD2（×40）

圖1 -3模型組LPAG左側DRD2（×40）

圖2 -1空白組LPAG右側DRD2（×40）

圖2 -2假手術組LPAG右側DRD2（×40）

圖2 -3模型組LPAG右側DRD2（×40）

3 討論

A11核團從PAG最前端開始延伸至下丘腦背側尾側，內側延伸至乳頭丘腦束［6］，是A8-A16多巴胺能細胞群中唯一對脊髓進行神經支配的核團［1］，通過毀損A11核團可制備 RLS模型［7］。

有學者認為動物的防御行為和DMPAG、DLPAG、LPAG有關［2］，若興奮尾側的LPAG可引起以肢體肌肉劇烈活動為主要特征的逃跑反應［3］。DRD2可對運動活性、疼痛產生影響［8］。對A11進行電刺激，可通過三叉神經頸復合體上的DRD2抑制疼痛信息，對A11毀損后，在三叉神經頸復合體上可見共同表達DRD2和5-HT1B/1D受體［9］，本課題組發現A11毀損后這兩種受體同時也存在PAG上［5］。PAG可能是內源性疼痛調節的最重要部位［4］，PAG傳遞的感覺信號受到多巴胺D1和D2樣受體的調節［10］。

多巴胺受體對多巴胺進行負反饋調節，當突觸中多巴胺含量減少時可激活突觸前膜D2自身受體，進而導致軸突末端多巴胺濃度增加［11］。動物研究表明D2受體拮抗劑或多巴胺濃度降低可以上調D2受體表達，而D2受體激動劑的慢性刺激可降低受體濃度，RLS病人D2受體密度增加可能與多巴胺能神經傳遞功能減退后引起受體表達上調有關［12］。

本研究發現RLS模型組大鼠雙側LPAG中多巴胺D2受體明顯增高，可能也是毀損A11后導致多巴胺合成減少進而引起多巴胺D2受體表達上調，LPAG雙側都受影響可能的原因：（1）毀損一側A11后引起對側A11多巴胺神經元減少，影響到雙側A11多巴胺下行通路。（2）三叉神經脊束核尾側亞核是三叉神經頸復合體重要組成部分，A11對三叉神經脊束核尾側亞核進行雙側投射［13］，而LPAG接受三叉神經脊束核的神經投射［2］。本研究仍有較多不足，需擴大樣本量進一步研究A11多巴胺神經具體如何下行。