丹酚酸A誘導小鼠白色脂肪組織褐變改善肥胖

來建飛 錢倩宇 丁秦超 李松濤 竇曉兵 陳林 朱林文思

肥胖已成為世界范圍內導致人類死亡的第五大因素，并可引起許多并發癥［1-2］。丹酚酸A（Sal A）是丹參中的水溶性天然多酚類化合物單體，具有抗氧化、抗炎癥、促進脂肪酸代謝等多種藥理特性及作用［3-6］。白色脂肪組織（WAT）和棕色脂肪組織（BAT）是哺乳動物體內兩種主要的脂肪組織［7-9］。外界藥物或寒冷刺激誘導可降低小鼠體重增加并刺激小鼠WAT褐變，增加棕色脂肪細胞標記基因（UCP1、PRDM16、PGC-1α、AMPK、Cidea）的表達［10-12］。本實驗室研究發現，腹腔注射丹酚酸A可誘導小鼠脂肪組織中UCP1和PGC-1α等蛋白高表達，從而逆轉高脂高糖飲食誘導的肥胖。本文從體內實驗明確Sal A促進脂肪細胞褐變的作用，為以Sal A為主治療肥胖癥的老藥新用研發提供新思路，對解決肥胖問題具有潛在價值。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 （1）儀器：倒置顯微鏡，日本OLMPUS公司，型號CKX31；微量紫外分光光度儀，美國Quawell公司，型號QWell 5000；臺式高速冷凍離心機，德國Beckman公司，型號5541RB31614；垂直電泳槽，美國 Bio-Rad 公司，型號 Mini PROTEAN? Tetra Cell；電泳儀，美國Bio-Rad公司，型號Power Pac；TMHC制冰機，浙江寧波格蘭特公司，型號XB-100；電子精密天平，美國Ohaus，型號AR1140。（2）材料：丹酚酸A，成都德思特生物技術有限公司，貨號：96574-01-5；生理鹽水，美國Sigma公司，貨號：S0817；普通固體飼料，美國Open Source Diet 公司，貨號：D12450B；標準高脂肪固體飼料，美國Open Source Diet 公司，貨號：批號D12492。Anti-UCP1 Antibody，美國Abcam公司，貨號：ab10983；Anti-PGC-1α Antibody美國Abcam公司，貨號：ab43003；Anti-GAPDH antibod，武漢博士德生物技術有限公司，貨號：A00227；Goat anti-Mouse IgG antibody，武漢博士德生物技術有限公司，貨號：BA1050。

1.2 實驗方法 （1）動物造模及組織樣本處理：將40只雄性C57BL/6小鼠置于（23±2）℃恒溫環境中喂養8周，可自由取食、飲水，光照/黑暗周期為12 h。小鼠適應喂養環境后隨機分為4組，每組10只，即正常飲食組（ND組，腹腔注射生理鹽水溶液），高脂高糖飲食組（HFD組，腹腔注射生理鹽水溶液），高脂高糖飲食與腹腔內注射20 mg/kg Sal A組（HFD-LS組），高脂肪和高碳水化合物飲食與腹腔內注射40 mg/kg Sal A組（HFD-HS組）。前2周，實驗老鼠均被喂食常規鼠糧；2周后，HFD組和Sal A處理組的小鼠均改為高脂高糖飲食8周。實驗結束后，所有小鼠均被處死，收集附睪脂肪并儲存于-80 ℃冰箱。

1.3 觀察指標 （1）小鼠的體重與每日食物攝入量：喂養期間，每周測量一次體重。（2）組織形態學觀察：附睪的脂肪樣本切成段（10 μm）使用Leica 低溫恒溫器，然后用蘇木精和伊紅染色（圓）可視化附睪的白色脂肪組織（eWAT）中脂肪細胞的大小，使用顯微鏡觀察4個隨機選擇的區域內細胞數量（100×100 μm），計算平均值。（3）基因與蛋白檢測：取適量小鼠附睪脂肪組織在冰上剪碎并置于試管中，分別提取RNA與蛋白質，進一步采用實時定量熒光PCR（RT-PCR）檢測脂肪組織內棕色化相關基因的表達水平，采用蛋白質印跡法（Western Blot）檢測脂肪組織內UCP1和PGC-1α的蛋白表達水平。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料符合正態分布，以（±s）表示，采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組小鼠的體重、每日食物攝取量比較 HFD-LS組和HFD-HS組的小鼠體重均明顯小于HFD組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 A.四組小鼠體重增長比較，#P＜0.05，★P＜0.05；B.四組小鼠每日食物攝取量比較

2.2 四組小鼠的附睪脂肪組織形態學觀察和附睪脂肪重量比較 見圖2。

圖2 A.附睪脂肪組織形態學照片；B.附睪脂肪組織重量；與ND組比較，#P＜0.05；與HFD組比較，★P＜0.05

2.3 四組小鼠附睪脂肪組織H&E染色結果比較 Sal A可減輕肥胖小鼠附睪脂肪細胞中的脂肪過度積累，見圖3。

2.4 四組小鼠附睪脂肪組織內棕色化相關基因的表達水平比較 Sal A可促使肥胖小鼠附睪脂肪中棕色脂肪細胞標志基因（UCP1、PRDM16、PGC-1α、AMPK、Cidea）高表達。見圖4。

2.5 四組小鼠附睪脂肪組織內UCP1和PGC-1α的蛋白表達水平比較 Sal A可促使肥胖小鼠附睪脂肪中UCP1和PGC-1α蛋白高表達，見圖5。

圖3 A.四組小鼠附睪脂肪組織H&E染色eWAT中脂肪細胞大小（100 μM）；B.四組小鼠附睪脂肪組織H&E染色切片的細胞數量/單位面積；與ND組比較，#P＜0.05；與HFD組比較，★P＜0.05

圖4 四組小鼠附睪脂肪組織內棕色化相關基因的表達水平比較；與ND組比較，#P＜0.05；與HFD組比較；★P＜0.05

圖5 四組小鼠附睪脂肪組織內UCP1和PGC-1α的蛋白表達水平比較；與ND組比較，#P＜0.05；與HFD組比較；★P＜0.05

3 討論

最新研究進展表明，某些藥理食材成分可促進哺乳動物增加能量消耗，減少脂肪堆積，促進白色脂肪褐變。本課題組初步試驗采用長期高脂高糖飲食喂養建立C57BL/6小鼠肥胖病模型。初步實驗結果表明，丹酚酸A干預可逆轉C57BL/6小鼠由高脂高糖飲食誘導的肥胖，且具有預防肥胖的作用。WANG等［13］研究表明，丹酚酸A可通過激活AMPK和線粒體改善肥胖相關疾病癥狀。然而，目前尚未有從促進脂肪細胞產生熱量來增加能量消耗即褐色化方面來探討丹酚酸A治療多種肥胖相關疾病發生發展的機制研究。查閱大量國內外相關文獻后，本課題組首次開展研究Sal A對HFD小鼠肥胖與WAT褐變的影響。筆者在C57BL/6小鼠中測試Sal A腹腔注射對HFD誘導的肥胖的影響，結果見圖2。通過測量小鼠附睪脂肪組織的eWAT質量來評估HFD誘導的脂肪過度積累，結果顯示與HFD組相比，HFDLS組和HFD-HS組小鼠的體重明顯降低，HFD組的附睪脂肪重量顯著減輕，且在食物攝入量上沒有差異。由此可見，在C57BL/6小鼠上Sal A具有預防高脂高糖飲食引起的肥胖的作用。C57BL/6小鼠附睪脂肪組織H&E染色eWAT中脂肪細胞大小比較，經Sal A處理的小鼠附睪脂肪組織內的脂肪細胞更小。

肥胖的特征是脂肪異常沉積，因此有必要研究脂肪組織中基因或蛋白質的變化。為了進一步探討Sal A預防肥胖的可能機制，本研究檢測分析與WAT褐變相關的基因和蛋白，結果表明Sal A可在基因水平上促進WAT中棕色脂肪細胞標記基因（UCP1、PRDM16、PGC-1α、AMPK、Cidea）的高表達，Sal A顯著增加小鼠脂肪組織中UCP1和PGC-1α的mRNA和蛋白表達水平。UCP1是一種產熱蛋白，在BAT中大量表達，WAT中UCP1表達的增加誘導了米色脂肪細胞的形成［14］。為進一步確定Sal A對小鼠附睪脂肪組織棕色化水平的調節作用，筆者又進行蛋白水平的實驗研究，結果發現高脂高糖飲食誘導會造成小鼠脂肪組織的產熱標志蛋白UCP1表達下降，而注射Sal A的小鼠附睪脂肪組織中UCP1和PGC-1α的蛋白表達水平較HFD組有顯著升高。實驗結果說明，Sal A可促使棕色脂肪細胞的標志蛋白UCP1在肥胖小鼠附睪脂肪中高表達；Sal A具有促進WAT褐變的能力，從而增加了能量消耗和產熱。DESHMUKH等［15］指出，人的成年期也會發生褐變，這表明白色脂肪組織的褐變是一種很有希望的策略，可以預防和/或治療肥胖和相關的共病，如2型糖尿病［16］。Sal A誘導WAT褐變增加能量消耗從而減少脂肪積累，達到預防肥胖疾病的作用。因此，Sal A可能是預防與治療肥胖癥及其代謝并發癥的候選藥物。