巴哈雀稗苗期對不同濃度磷脅迫的生理適應機制

劉 芳， 黃莉娟， 王普昶， 趙麗麗,3*

(1.貴州大學動物科學學院草業科學系， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省草業研究所， 貴州 貴陽 550006； 3.國家喀斯特石漠化防治工程技術研究中心，貴州 貴陽 550001)

巴哈雀稗(Paspalumnotatum)為禾本科雀稗屬的多年生草本，耐貧瘠、適應性強；不僅營養豐富、飼用價值優良，還被人們用于水土保持、防風固沙、改良土壤理化性質和生態環境的防護[18-19]。其“一草多用”的功能對貴州發展畜牧業和保持水土流失具有重要作用。目前對巴哈雀稗的研究較少，國內的研究主要集中在鹽和干旱的脅迫[20]，種子休眠機理及破除方法[21]；國外主要集中在致敏蛋白[22]、泡狀叢枝菌根真菌的研究[23]，而關于其耐低磷的研究較少。貴州磷素的缺乏限制了巴哈雀稗的推廣種植，因此，本文以砂培方式人工模擬不同供磷水平，探究巴哈雀稗在磷脅迫下的根系形態、葉片形態和生理生化的適應性變化，發掘巴哈雀稗生長的適宜磷濃度，對減少土壤有限磷養分的消耗、提高磷的利用率以及從生物學途徑緩解因土壤缺磷或施磷過多富集對巴哈雀稗生長的不利影響具有重要意義[24]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

選取健康飽滿的巴哈雀稗種子，用75%的乙醇消毒5 min，然后用蒸餾水沖洗干凈，置于鋪滿2層濾紙的培養皿中，放入恒溫恒濕培養箱中25℃恒溫培養，待出苗7 d后，選取整齊、發育一致的巴哈雀稗苗移栽到石英砂塑料盆中(長26 cm、寬12 cm、高15 cm)，在1/2全營養液培養15 d后全營養液再培養10 d，待其長至三葉一心時進行脅迫處理。供試營養液為改良的Hoagland與阿農微量元素混合液[25]，營養液配方為：KH2PO40.2 mmol·L-1，K2SO40.75 mmol·L-1，MgSO4·7H2O 0.65 mmol·L-1，Ca(NO3)2·4H2O 2 mmol·L-1，EDTA-Fe 0.1 mmol·L-1，H3BO41.0×10-3mmol·L-1，MnSO4·H2O 1×10-3mmol·L-1，ZnSO4·7H2O 1.0×10-3mmol·L-1，CuSO4·5H2O 0.5×10-3mmol·L-1，(NH4)6MO7O24·4H2O 0.05×10-4mmol·L-1，營養液pH值為6.20。全營養液中的磷(KH2PO4)水平分別設置2 μmol·L-1(P1)，20 μmol·L-1(P2)，200 μmol·L-1(P3)，600 μmol·L-1(P4)，1 000 μmol·L-1(P5)5個處理，每個磷濃度3盆，共移栽15盆，每盆22株。利用K2SO4調節營養液中K+濃度，使K+濃度維持在1 700 μmol·L-1。在脅迫10 d，20 d和30 d時測量生理指標，試驗30 d結束時，分別測量地上和地下的形態指標。

1.2 試驗方法

1.2.1植株形態指標 葉形、株高、生物量、根系，每個指標10次重復。其中，葉形指標用葉片掃描儀測量葉長、葉寬、葉長寬比及葉面積，將掃描后的圖片用Win RHIZO軟件進行分析。株高用直尺量取地上部分拉直后的植株高度。生物量測定是取出整植株，將地上部分和地下部分分離后，分別稱量地上和地下鮮重，之后置于105℃殺青30 min，65℃烘干至恒重測其干重。根系指標測定是用ScanMaker 9800XL plus掃描根系，獲取總根長、根表面積、根體積、根平均直徑、根尖數、根分枝數。

1.2.2生理指標 取第2～3片葉片，進行各生理指標的測量，每個指標3次重復，葉綠素(chlorophy，Chl)采用丙酮-乙醇混合液法[26]測定；電導率(conductivity)采用浸泡法[27]測定；可溶性糖(soluble sugar，SS)含量采用蒽酮比色法[28]測定；脯氨酸(proline，PRO)用酸性茚三酮比色法[29]測定；丙二醛(malonaldehyde，MDA)采用硫代巴比妥酸法[30]測定；可溶性蛋白(soluble protein，SP)采用雙縮脲法[31]測定；過氧化物酶(peroxidase，POD)用活性愈創木酚法[32]測定；過氧化氫酶(catalase，CAT)用紫外分光光度法[33]測定；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)用氮藍四唑光還原法[34]測定；根部酸性磷酸酶活性(root acid phosphatase，ACP)選取根部，采用對硝基苯磷酸二鈉法測定[35]。

1.3 試驗數據處理與分析

用Microsoft Excel 2010進行圖表的繪制，采用SPSS 20統計軟件進行單因素方差分析，采用Duncan方法進行多重比較。參照鄭清嶺等[36]的研究，采用主成分分析結合模糊隸屬函數公式對試驗處理效果進行綜合分析。計算公式如下：

μ(Xi)=(Xi-Ximin)/(Ximax-Ximin)(i=1,2,3)

(1)

(2)

(3)

其中，μ(Xi)為各處理Xi的隸屬函數值，Xi為各處理綜合指標i的值，Ximax和Ximin分別為各處理Xi的最大值和最小值，Pi為綜合指標i的貢獻率，Wi為綜合指標i的權重，D為各處理的綜合評價值。

2 結果與分析

2.1 磷對巴哈雀稗形態特征的影響

2.1.1根系形態特征 根系是植株在土壤中吸收磷素的重要部位，植株體內的磷素很大程度上取決于根系吸收磷的含量。根系形態在5個不同供磷水平下的差異明顯。由表1可知，在低磷或者高磷水平，根表面積、總根長、總根體積、根分枝數和根尖數均有不同程度的下降，且均在P2水平值最大，與各個處理間差異顯著(P<0.05)；而根平均直徑隨著供磷水平的升高而升高，在P5磷水平直徑最大。

表1 不同供磷水平對巴哈雀稗根形態的影響

2.1.2葉片形態特征 如表2所示，隨著供磷水平的升高，葉面積、葉長、葉寬、葉周長均呈現先升高再降低的趨勢，在P4磷水平達到最大值，P1水平下最低。在P1,P2磷水平處理間各個指標差異不顯著；在P2和P3磷水平處理間葉面積、葉長、葉寬的差異顯著(P<0.05)；在P3和P4磷水平處理間葉長、葉周長差異顯著(P<0.05)；在P4和P5磷水平處理間葉面積、葉長、葉寬、葉周長差異顯著(P<0.05)；長寬比和葉形系數在各個處理間差異不顯著。

表2 不同供磷水平對巴哈雀稗葉片形態的影響

2.1.3生物量與根冠比 生物量與根冠比可以反映植物生長發育的情況。由表3可知，隨供磷水平的提高，莖葉鮮重和干重呈現先上升再下降的趨勢，在P4磷水平為最大值，顯著高于其他供磷水平(P<0.05)；根系鮮重和干重在P2磷水平下為最高值，且顯著高于其他供磷水平(P<0.05)；鮮重根冠比和干重根冠比均呈現先上升再下降的趨勢，在P2磷水平為最大值，顯著高于其他供磷水平(P<0.05)；株高在P4磷水平為最大值，高于其他供磷水平。

表3 不同供磷水平對巴哈雀稗株高及生物量的影響

2.2 磷對巴哈雀稗生理特性的影響

2.2.1脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白(SP)、可溶性糖(SS)、葉綠素(Chl)含量 脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖是植物體內的滲透調節物質，在同一供磷水平下的含量均隨脅迫時間的持續呈現上升趨勢。由圖1可知，在10 d,20 d,30 d時，脯氨酸含量均隨著供磷水平的升高而降低，在P1供磷水平下最高(5.96 g·mL-1，14.34 g·mL-1，30.56 g·mL-1)，在P5供磷水平時最低(1.44 g·mL-1，1.73 g·mL-1，17.55 g·mL-1)。在10 d，20 d，30 d時，可溶性蛋白和可溶性糖含量均隨供磷水平的升高呈現先升高后降低的趨勢，在P3，P4磷水平高于其他磷水平，P1磷水平時最低。在磷脅迫的3個時期，葉綠素的含量呈現先升高后降低的趨勢，且均在P4磷水平時值最大、P1磷水平含量最低，葉綠素含量排序為：P4>P3>P2>P5>P1。

由此可見，磷元素的豐缺影響植株脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖和葉綠素的合成。

圖1 不同供磷水平對脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白和葉綠素含量的影響

2.2.2丙二醛(MDA)含量及電導率 丙二醛和電導率反映逆境對細胞膜的傷害程度。由圖2可知，在10 d，20 d，30 d時，丙二醛和電導率的含量隨著供磷水平的升高呈現先下降后升高的趨勢，P3，P4磷水平處的電導率顯著低于其他3個磷水平(P<0.05)，且隨著脅迫時間的延長，丙二醛含量變化呈升高趨勢，表明過低或者過高磷濃度會破壞細胞膜，對細胞膜的傷害程度隨脅迫時間的延長而增加。

圖2 不同供磷水平對丙二醛和電導率的影響

2.2.3酶活性 由圖3可知，過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性在3個時期變化趨勢大致相同，均隨供磷水平的增加表現先降低后升高的趨勢，且隨著脅迫時間的持續酶活性升高。CAT在P1，P2處活性較高，在P3，P4磷水平下較低。POD和SOD在高于或者低于P4磷水平呈上升趨勢，POD在P4磷水平時活性最低，SOD在P3，P4磷水平時較低。根系分泌的酸性磷酸酶(ACP)隨著供磷水平的升高呈現下降趨勢，ACP活性最高和最低分別是P1和P5磷水平。綜上分析，P3，P4磷水平下巴哈雀稗的自由基較少，需要的酶活性較低。

2.3 巴哈雀稗適應不同供磷水平的綜合評價

單一指標不能反映巴哈雀稗的對不同磷濃度適應的積極性，主成分分析是利用降維的方法，將多個變量簡化為較少的變量，不僅簡化了數據，又體現了變量之間的相關性。為了探究不同供磷水平對巴哈雀稗形態變異和生理影響的總效應，采用主成分分析法對第30 d的各形態、生理共27個指標進行了主成分提取，將27個指標轉化為3個新的綜合指標，提取的3個主成分的特征值均大于1，累積貢獻率達93.43%，對數據的變異具有較高的解釋。其中主成分1(PC1)到主成分3(PC3)分別解釋了57.05%，22.25%，14.13%的變異。第1主成分中，葉片鮮重、葉片干重、CHL,SS的載荷值相對較大。第2主成分中，Pro、根分枝數、根尖數、ACP的載荷值相對較大。第3主成分中，根系鮮重、總根體積、根總面積、根系干重的載荷值相對較大，是對磷元素供給敏感的指標(表4)。

圖3 不同供磷水平對保護酶(SOD,POD,CAT,ACP)活性的影響

由主成分分析結果可得3個綜合指標的線性方程組。其中，X1，X2，X3分別代表了3個主成分，以各指標的載荷值為系數，x1—x27分別代表總根長、根表面積、總根體積、根平均直徑、根尖數、根分枝數、葉面積、葉長、葉寬、葉長寬比、葉周長、葉形系數、株高、莖葉鮮重、根系鮮重、莖葉干重、根系干重、CAT，POD，SOD，Pro，SS，SP，MDA，CHL、電導率、ACP的27個指標，分別用5個供磷水平下的各個指標的平均值乘以相應指標的系數，得到關于5個供磷水平下的3個主成分的綜合指標值(表5)。

表4 主成分載荷矩陣及貢獻率

續表4

X1=0.015x1+0.022x2-0.013x3-0.014x4+0.016x5+0.022x6+0.075x7+0.033x8+0.056x9-0.07x10+0.074x11+0.033x12+0.111x13+0.099x14+0.007x15+0.095x16+0.041x17+0.013x18+0.039x19+0.073x20-0.073x21+0.091x22+0.076x23+0.086x24+0.092x25+0.067x26-0.025x27。

X2=-0.108x1-0.037x2-0.034x3+0.108x4-0.111x5-0.115x6+0.007x7+0.063x8+0.034x9+0.125x10+0.000x11+0.038x12-0.081x13-0.064x14-0.012x15-0.043x16-0.047x17+0.076x18+0.052x19+0.012x20+0.136x21-0.034x22-0.020x23-0.013x24-0.037x25+0.017x26+0.11x27。

X3=0.064x1+0.219x2+0.229x3-0.008x4+0.064x5+0.066x6-0.014x7-0.001x8-0.005x9+0.08x10-0.065x11+0.067x12-0.009x13-0.04x14-0.237x15-0.025x16-0.218x17+0.062x18-0.007x19-0.035x20+0.042x21+0.028x22+0.074x23-0.009x24+0.032x25+0.010x26+0.065x27。

通過模糊隸屬函數公式求出不同供磷水平對巴哈雀稗的模糊隸屬函數值、各指標的權重以及綜合評價值。綜合評價值越大表明對巴哈雀稗的生長作用越強，結果表明，P4的綜合評價值最大(0.785)，綜合排名為第1，表明P4磷水平對巴哈雀稗的生長最有利(表5)。

表5 不同供磷水平對巴哈雀稗幼苗形態和生理指標的隸屬函數值

3 討論

3.1 巴哈雀稗對不同供磷水平的形態適應

植物吸收磷的效率與供磷水平有關，即吸收效率隨供磷量的增加而升高，為了適應不同磷環境，植物在進化過程中形成了包括根系形態、葉片形態和生理生化等一系列復雜的適應性調節機制。

巴哈雀稗的根系形態和葉片形態對不同供磷水平有不同的響應，根是感受外源磷變化進而調節根尖分生組織的部位，接收并傳遞脅迫信號后作出反應，再反饋調節作用于根部發生適應性調整。磷饑餓時，分生組織細胞減少[37]，根毛通過增加根表面積和以耗費最小的代謝能吸收磷而獲取競爭優勢[37-38]。巴哈雀稗在P2磷水平下的根系生物量最大，根表面積、總根長、總根體積、根分枝數和根尖數明顯高于其他水平，隨著供磷水平的上升，以上根系指標均逐漸變小，說明在較低的磷水平下(P2)，巴哈雀稗為了吸收更多的磷營養，把吸收到的養分更多用于發展根部，通過縮小根直徑，增加側根、叢生根、延長根系長度，形成根系網絡，擴大根部與土壤的接觸面積，進而促進根尖分生區對磷素的吸收。這與蔡麗平等對類蘆[39]、張恩和等對春蠶豆[40]的研究結果一致。而在P1磷水平下的根系發育反而比P2磷水平差，可能是因為供磷水平過低，植物生理代謝無法調節造成根系發育受阻。株高和莖葉的鮮重、干重隨磷水平的升高而先增加后降小，在P4磷水平發育最好。有研究表明，紫花苜蓿在低磷脅迫的根冠比中磷要高[41]。本文研究中根冠比不論是鮮重還是干重均在P2，P3磷水平較高，P4，P5磷水平較低，這一現象又進一步驗證了在較低磷水平，植物會通過調節地上和根系生物量的生長，增強根系的發育來適應供磷不足的逆境。

3.2 巴哈雀稗對不同供磷水平的生理適應

在正常情況下，細胞內自由基的產生和清除處于動態平衡狀態，當植物受到脅迫打破平衡時，逆境會加速植物組織中膜脂過氧化鏈式反應，導致自由基(O2-)、羥基自由基(OH-)、過氧化氫(H2O2)、單線態氧(O2)等超氧化物陰離子積累過多造成一系列生理生化紊亂。MDA不僅能與細胞內各種物質發生強烈反應，造成細胞功能不可修復的喪失和不正常的死亡，還會破壞細胞中許多生物功能分子，比如蛋白質、核酸等[42]。本研究中，巴哈雀稗在P1,P2和P5供磷水平下3個時期的電導率和MDA含量均較高，表明細胞膜脂過氧化程度更高，膜透性遭到破壞導致細胞液外滲。前人研究表明，磷的缺乏或者過剩導致蛋白質合成代謝受阻[43-44],可溶性糖含量減少[45]。在本研究中，3個脅迫時期下，巴哈雀稗在較低或較高的磷水平時葉綠素合成受阻，合成有機物的速率減慢，相應的SP和SS的合成也減少。原因可能是巴哈雀稗在磷素缺乏或者過多時產生了傷害，抑制可溶性糖和可溶性蛋白的合成。為保持不同磷環境的滲透勢，除了可溶性糖、蛋白質以外，植物會調節體內脯氨酸的含量。脯氨酸是最有效的滲透調節物質，在逆境條件下對植物可能起到兼容性滲透調節劑、蛋白質和亞細胞結構穩定劑等作用[46]。3個脅迫時期下，在較低磷水平(P1，P2)，巴哈雀稗通過促進自身合成脯氨酸來降低滲透勢進而吸收更多的磷，而隨著磷濃度的升高，介質中能吸收到的磷元素增多，脯氨酸合成減少以穩定滲透勢保持膜系統的完整。由此可見，在P3，P4磷水平更適合巴哈雀稗的生長發育；在較低或者較高磷水平不利于細胞內葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白的合成積累；巴哈雀稗通過調節可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸的含量來共同維持細胞滲透勢以適應外部磷水平變化的環境。

磷脅迫不僅能升高細胞活性氧水平，還能誘導植物保護系統的建立[47]，POD，SOD，CAT這些保護酶清除細胞內產生的活性氧，維持細胞功能正常發揮[37]。POD具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用，在低磷水平(P1)和高磷水平(P5)下巴哈雀稗POD酶活性顯著增強以分解H2O2(圖3)。超氧化物歧化酶(SOD)可以與產生過量的自由基發生反應，產生H2O2和O2，在低磷水平(P1)和高磷水平(P5)顯著增強(圖3)。H2O2主要由CAT清除，最后分解形成H2O和O2，在低磷水平(P1、P2)的巴哈雀稗CAT酶活性顯著增強(圖3)，且活性遠遠高于POD，SOD活性，原因可能是CAT在磷脅迫中起著最為重要的保護作用，細胞中通過SOD途徑產生的和本身存在于細胞內的H2O2都需要CAT的清除。隨著自由基含量下降，保護酶活性也下降，總體來說，在P3，P4磷水平時各種酶活性較低，表明需要消除的有害物質較少，活性氧物質通過過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶和各種還原酶等共同的作用而清除[47]。根系內源酸性磷酸酶活性增強促進根系對周圍磷的活化、增加有效磷進入細胞[48-49]。巴哈雀稗ACP隨磷水平增加而降低，說明在磷水平低的情況下，巴哈雀稗增強酸性磷酸酶的活性，活化土壤中難溶性磷進而加快磷素代謝來彌補磷缺乏，提高磷利用效率，而高磷水平則抑制巴哈雀稗根部酸性磷酸酶的分泌。

3.3 巴哈雀稗適應不同供磷水平的綜合評價

巴哈雀稗對不同供磷水平的適應是一個復雜的反應，從形態、生理的某個指標不能反映巴哈雀稗的生長情況，故利用主成分分析和模糊隸屬函數結合的方法對不同供磷水平下巴哈雀稗幼苗各指標進行綜合評價。由表5可知，各磷水平脅迫處理下巴哈雀稗幼苗各生長和生理指標的綜合評價值大小為P4>P3>P5>P2>P1，其中P4，P3綜合評價值較高，表明在P4,P3磷水平較適合巴哈雀稗的生長。P5和P2磷水平比P4，P3磷水平綜合得分低，并且得分相近，這表明在高磷(P5)和低磷(P2)脅迫下均影響了巴哈的生長發育；高磷水平(P5)所提供的磷濃度能夠滿足巴哈雀稗對磷的需求，而較低磷水平(P2)下巴哈雀稗通過根系形態的變化改變對磷的吸收來提高磷的吸收效率促進生長，進而與P5高磷水平生長發育相當。

4 結論

在低磷條件下，巴哈雀稗通過減少葉面積、葉長、葉寬、葉周長、莖葉干重、鮮重等地上部分生物量，增加根面積、總根長、根分枝數和根尖數等地下部分生物量的比例來適應磷缺乏的逆境。在較低或者較高的磷水平，膜透性遭到破壞，葉綠素合成受阻，可溶性蛋白和可溶性糖減少；脯氨酸與可溶性糖、可溶性蛋白的含量發生不同的變化共同維持細胞內環境的穩定；保護酶活性升高以清除細胞內過量的ROS物質。綜合評價的結果得出600 μmol·L-1(P4)磷水平最適合巴哈雀稗的生長；相比葉片形態和生理上的差異，各個供磷水平間根系有較大的差異性，根系發育良好為巴哈雀稗競爭吸收到更多的磷提供了重要的優勢。