叢枝菌根真菌與根瘤菌對3種豆禾混播植物種間互作的影響

潘 越， 周冀瓊， 郭 川， 楊 喆， 劉 琳， 閆艷紅， 趙艷蘭， 劉 珊， 孫飛達

(四川農業大學草業科技學院,四川成都 611130)

種植高產優質的多年生豆禾混播人工草地，不僅能夠提高飼草產量或品質，而且可以改良培肥土壤，減少水土流失，促進草食畜牧業的發展。研究表明，豆禾混播組合中不同種類植物在形態、生長發育、營養資源利用、時空生態層位都存在著不同程度的生態位互補[1]。土壤微生物群落是影響植物群落生產力和群落結構的重要驅動因子之一[2-3]。叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)和根瘤菌是兩類重要的土壤微生物，能與宿主植物產生共生關系，協助宿主植物獲取生長所需的礦質營養[3-4]。目前已有大量研究探討了氣候變化、放牧干擾、土壤非生物因子對豆禾混播草地植物群落生產力、多樣性和穩定性的影響及其作用機制[4]，而關于地下微生物，特別是AMF和根瘤菌對豆禾混播植物群落種間關系的調控作用仍不明確[5]。

研究表明，宿主植物可識別土壤中有益的AMF，并將光合產物供給AMF；而AMF則可幫助宿主植物吸收土壤中的養分，尤其是移動性較差的礦質營養，從而形成一種雙向獎勵機制[6]。根瘤菌能侵染豆科植物形成根瘤進行生物固氮。AMF對豆科植物有較好的共生性能[5]，促進豆科植物生長及根瘤固氮作用的發揮。豆科植物雙接AMF和根瘤菌的優越性一般高于單接種：一方面，AMF可幫助植物高效利用水分并吸收磷素，彌補了根瘤菌固氮時的磷限制，且AMF可促進植物的光合作用，為土壤中的微生物提供更多的碳水化合物，促進根瘤菌固氮作用的發揮[7-8]；另一方面，根瘤菌通過生物固氮可為AMF合成細胞壁的主要成分甲殼素提供氮素等必需元素，因此，豆科結瘤和叢枝菌根形成常被認為是存在相互協同作用的[9]。AMF和根瘤菌通過調節宿主植物對二者碳水化合物的分配，并改變彼此協助植物吸收養分的能力，對植物群落產生正向或反向的交互作用[10]。由于AMF和根瘤菌對宿主植物所供給的光合產物有較高的需求，且植物對AMF或根瘤菌的依賴性有所差異，使得這種互利共生關系在不同植物間表現不同。前人通過meta分析發現，AMF和根瘤菌雙接種并未對宿主植物的生長產生顯著的加和效應，主要受到環境養分、宿主植物的生長階段等因素的影響[5,11]。土壤中較低的氮磷比有利于生長速率快的植物生長，這類植物往往具有發達的根系，或者自身具備生物固氮的潛能。當環境中氮磷比較高時，一些生長較慢的叢生型植物可以通過根系或者根部共生體——叢枝菌根汲取土壤中有限的磷[12]。除此之外，AMF和根瘤菌對植物群落的反饋調節作用還受到AMF或根瘤菌的種類,植物向地下輸入的碳水化合物的含量，以及根際微生態的影響[13]。

白三葉(Trifoliumrepens)、多年生黑麥草(Loliumperenne)和鴨茅(Dactylisglomerata)是西南山地丘陵區常見的豆禾混播草種，可用于建立高產穩定的人工割草地及放牧草場。但是由于草種比例不當及后期管理缺失等原因，3種植物混播的人工草地常出現牧草生長不良、種間競爭激烈、草群結構穩定性差等問題。AMF、根瘤菌可直接影響豆科和禾本科牧草的養分循環及競爭過程[14]，目前對于AMF-根瘤菌共生體的研究多集中在二者對單個物種生長及養分轉移方面[15]，而AMF和根瘤菌對豆禾混播群落生產力及種間關系的影響仍未見定論[16]。本試驗通過對白三葉、多年生黑麥草、鴨茅構建的混播組合接種AMF和根瘤菌，探討AMF和根瘤菌對豆禾混播植物生產力及種間關系的調控機理，以期為建立高產穩定豆禾混播草地及退化草地修復中有益微生物的應用提供科學依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

盆栽試驗設在四川農業大學智能溫室內，于2019年3月—2019年12月進行。采用三因素完全隨機試驗設計：因素一為播種方式，包括單播白三葉、單播鴨茅、單播多年生黑麥草和白三葉+鴨茅+多年生黑麥草混播4個水平；因素二為接種AMF，包括接種AMF處理(+AMF)和不接種AMF處理(-AMF)；因素三為接種根瘤菌，包括接種根瘤菌處理(+R)以及不接種根瘤菌處理(-R)。由于接種根瘤菌處理對兩種禾本科植物單播處理無意義，因此對于單播鴨茅和單播多年生黑麥草處理只做+AMF處理及-AMF處理。共12個處理，每個處理重復4次，共48盆。

1.2 試驗材料

供試植物品種為‘海法’白三葉、‘凱力’多年生黑麥草、‘寶興’鴨茅。

用未經滅菌的原位土砂混合基質作為接種AMF處理的接種菌劑。這種接種方式與滅菌后重新接種一種或多種AM真菌的接種方式可取得相似的接種效果[17-18]，目前在AMF盆栽接種試驗中得到廣泛應用[19-21]。盡管用未經滅菌的土砂混合基質進行接種時無法很好的獲知接種基質中AM真菌的具體種類，但是未經滅菌的土砂混合基質中包含多種AM真菌的菌絲及孢子，有利于宿主植物被常見的AM真菌種侵染定殖，而且收集的原位土壤更加接近田間土壤的物理及化學營養條件。為了確定原位土砂混合基質的接種潛力，取部分基質檢測其中AMF孢子含量[22]，得出每100 g未滅菌的土砂混合基質中約含87個AM孢子。

供試根瘤菌為白三葉根瘤菌ACCC18007，由中國農業科學院土壤肥料研究所提供。

土壤基質采于四川農業大學教學科研園區，地理坐標為103°39′ E，30°32′ N，海拔為508 m。該地屬四川盆地亞熱帶濕潤季風氣候，年降水量1 012 mm，年均溫15.9℃，1月均溫5.4℃，≥0℃年積溫5 830℃，年日照1 161 h，無霜期283 d。主要種植的植物有白三葉、多年生黑麥草、鴨茅等多年生豆禾混播牧草品種。

1.3 試驗方法

1.3.1育苗 試供種子表面滅菌：將種子浸泡在5%的次氯酸鈉1 min，再浸泡于50%的乙醇2 min，用蒸餾水反復沖洗干凈后置于滅菌的蛭石上進行萌發培養。每隔2天澆一次水，確保水分充足。

1.3.2培養基質準備 土壤過2 mm的篩，去除石塊及植物根莖殘枝等。購買商用河砂，按土壤∶砂1∶3的比例混合均勻。將混合基質均分為兩部分，一部分放在4℃冷庫保存用于+AMF處理；另一部分土高壓蒸汽滅菌(121℃)2 h后于無菌環境中冷卻12 h，裝入4 L花盆(21.5 cm直徑×21.5 cm高)備用，每個花盆裝有約6 kg土砂混合培養基質?；旌匣|的有機質含量為2.65%，全氮含量為2.1 g·kg-1，堿解氮含量為118 mg·kg-1，速效磷含量為9.3 mg·kg-1，速效鉀含量為101 mg·kg-1，pH值為6.3。為避免污染，試驗中花盆及工具等均需提前用肥皂水反復清潔，并在95%的乙醇中浸泡滅菌。

1.3.3接種AMF +AMF的處理為未經滅菌的土砂混合基質[23]，-AMF的處理為蒸汽滅菌后的土砂混合基質加上除AMF外的其它土壤微生物的土壤濾液(濾液的提取方法：未滅菌的土壤和水按 1∶2混合，充分攪拌后過25 μm的篩)。研究表明，細菌等其他微生物體積較小，能通過25 μm的篩；而AMF孢子的體積大于25 μm。因此，濾液中包含除AMF孢子以外的其他大多數土壤微生物[24-25]。每個-AMF處理需要加入100 mL土壤濾液，每個+AMF處理的花盆中加入100 mL無菌水。

1.3.4接種根瘤菌劑 將白三葉根瘤菌ACCC18007接種到YMA斜面進行活化，然后在25℃條件下恒溫培養3 d后轉于裝有1 000 mL YMA培養液的三角瓶中，振蕩30 h，培養至對數生長期(OD600 nm= 0.812)，離心濃縮并用無菌水重懸，配制成菌懸液(菌數>1×109CUF·mL-1)。每個+R處理的盆中接種100 mL根瘤菌劑，-R處理注射100 mL無菌水[26]。

1.3.5種苗移栽 種子播種約25 d后進行幼苗移栽。選取長勢相同的1種植物6株均勻移栽在1個花盆里，作為單播處理；選取長勢相同的3種植物各2株移栽于1個花盆，每盆中共6株，不同種植物間隔并分布均勻。移栽1周內及時觀察幼苗生長情況，若出現植物死亡，則選取生長良好的同種植物進行替換。將花盆置于溫室中，采用隨機排列法，每2周換位1次，采用自然光照，溫度為(20～30/15～25)℃(白天/晚上)。前期澆水2天1次，后期3天1次，確保水分充足。為了補充植物所需要的必需元素，且保證接種的AMF和根瘤菌能在低氮磷的土壤環境中充分發揮作用，移栽植物1個月后每周補充1次修正后低氮磷濃度的Hoagland培養液(Hoagland培養液配方:四水硝酸鈣945 mg·L-1，硫酸鉀505 mg·L-1，七水硫酸鎂493 mg·L-1，鐵鹽溶液22.5 mg·L-1，微量元素液5.151 mg·L-1)[27]。

1.3.6指標測定及方法 生長季內，每10 d測量1次各植物自然高度。待植物生長至18周時收獲所有植物。將每種植物從莖基部分開，分別將地上、地下兩部分放置于105℃條件下殺青30 min，然后置于70℃烘干至恒重后測定地上、地下生物量。

用清水小心沖洗植物根系，注意保存根系和白三葉根瘤的完整性。用鑷子將白三葉根系上的根瘤小心摘下，記錄單株有效根瘤數(根瘤顏色呈現粉紅色)及總根瘤數。

采用曲利苯蘭染色法[28]測定菌根侵染率，鏡檢采用放大交叉法(magnified intersections method[29])，觀察并記錄根系的菌根侵染強度。菌絲強度由根部侵染的囊泡、菌絲及叢枝共同決定。

分別使用鉬銻抗吸光光度法、凱氏定氮法來測定植物全磷、全氮含量[30]。

1.4 數據分析

用菌根依賴性(Mycorrhizal dependence，MD)表示在特定的土壤養分水平下植物生物量積累對菌根環境的依賴性[31]。MD計算公式為：MD(%)=100×(BA-BNA)/BA(BA表示接種AMF后植物的生物量，BNA表示不接種AMF時植物的生物量；MD越大表示宿主植物對AMF的依賴程度越高)。用軟件SPSS 22.0(Statistical Product and Service Solutions;Watson;NC;USA)分析數據。采用三因素方差分析播種方式、接種AMF、接種根瘤菌以及三者的交互作用對白三葉株高、生物量、根瘤數、相對生物量、根冠比、AMF菌根侵染率、植物N，P吸收的影響；采用兩因素方差分析播種方式、接種AMF以及二者的交互作用對多年生黑麥草和鴨茅株高、生物量、根冠比、AMF菌根侵染率、植物N,P吸收的影響。用Spearman相關分析檢驗各物種根系侵染率與地上生物量及地上部分養分含量的相關性。采用Sigmaplot 12.0和Excel 2010制作相關圖表。

2 結果與分析

無論是單播還是混播組合，接種AMF和根瘤菌均在不同程度影響了3種植物的株高、地上和地下生物量、根冠比、菌根侵染率及植物地上部的氮磷含量(表1)。

表1 不同播種方式(PP)、AMF(A)及根瘤菌(R)接種及交互作用對3種植物的株高和生物量、白三葉結瘤、相對生物量、根冠比、菌根侵染率、菌根依賴性、植物地上部分的氮、磷含量的方差分析結果

2.1 不同播種方式下接種AMF和根瘤菌對植物株高的影響

白三葉的株高在混播處理中顯著低于單播處理(P<0.05)；相比-AMF處理，+AMF顯著增加了混播中白三葉的株高(P<0.05)，平均增加8.4 cm；根瘤菌接種對白三葉的株高未產生顯著影響。鴨茅在混播中的株高顯著高于單播處理，接種AMF未對鴨茅株高產生顯著性影響。多年生黑麥草的株高在所有處理中均無顯著差異(圖1b)。

圖1 不同播種方式下接種AMF和根瘤菌對(a)白三葉、(b)多年生黑麥草、(c)鴨茅株高的影響

2.2 不同播種方式下接種AMF和根瘤菌對植物生物量的影響

2.2.1地上、地下生物量 在混播處理中，白三葉的地上、地下生物量均顯著低于單播處理(P<0.001)，而鴨茅的地上生物量顯著高于單播處理；相比-AMF對照，+AMF顯著增加了混播中白三葉的地上生物量(P<0.001)，單播+AMF-R處理中白三葉地下生物量最高，達到0.83 g·株-1，在混播中，+AMF+R處理中的白三葉地下生物量要顯著高于其他混播接種處理，達到0.56 g·株-1；混播中多年生黑麥草(P<0.05)和鴨茅(P<0.01)的地上生物量在+AMF處理下顯著低于-AMF處理，但這2種禾草的地下生物量均未受到播種方式、接種AMF或接種根瘤菌的顯著性影響；此外，混播處理中，+AMF的植物總地上生物量顯著低于-AMF處理(P<0.05)；接種根瘤菌對3種植物的總地上生物量無顯著影響，但接種AMF和根瘤菌對地下生物量有交互作用(圖2)。

圖2 不同播種方式下接種AMF和根瘤菌對(a)白三葉、(b)多年生黑麥草、(c)鴨茅的地上、地下生物量以及(d)群落總地上、地下生物量的影響

2.2.2相對生物量 無論是否接種AMF，鴨茅在混播處理下均為優勢物種，其相對生物量超過50%，多年生黑麥草次之，白三葉的相對生物量最小。相比-AMF處理，+AMF顯著增加了白三葉在群落中的相對生物量(P<0.05)，但降低了鴨茅的相對生物量；此外，+R處理中鴨茅的相對生物量顯著高于-R處理(P<0.05)(圖3)。

2.2.3根冠比 相比單播處理，混播處理顯著增加了白三葉的根冠比(P<0.05)，但是降低了多年生黑麥草和鴨茅的根冠比(表1和表2)；混播+R處理中白三葉的根冠比達到最高。單播處理中，+AMF處理中鴨茅的根冠比最高(表2)。

2.3 不同播種方式下接種AMF和根瘤菌對白三葉結瘤數的影響

無論單播或是混播，+AMF+R處理中白三葉的根系結瘤數均為最高，平均結瘤數為63 個·株-1，而-AMF-R處理中白三葉的根系結瘤數平均僅為17個·株-1(圖4)。

圖3 混播條件中不同接種方式對白三葉、多年生黑麥草及鴨茅的相對生物量的影響

表2 不同播種方式下接種AMF及根瘤菌對3種植物根冠比的影響

圖4 不同播種方式下接種AMF和根瘤菌對白三葉結瘤數的影響

2.4 不同播種方式下接種AMF和根瘤菌對菌根侵染的影響

2.4.1菌根侵染率 多年生黑麥草的菌根侵染率在混播處理中明顯高于單播處理(P<0.05)，鴨茅和白三葉的菌根侵染率在不同的播種方式下無顯著差異。

與-AMF處理相比，+AMF均顯著提高了3種植物的菌根侵染率(圖5)。

2.4.2菌根依賴性 相比單播處理，白三葉的菌根依賴性在混播處理中顯著提高(F=454.65，P<0.001)，而多年生黑麥草和鴨茅的菌根依賴性在單播混播中無顯著差異。與-R處理相比，+R顯著提高單播處理中白三葉的菌根依賴性(P<0.001)和混播處理中多年生黑麥草的菌根依賴性(P<0.05)(表3)。

圖5 不同播種方式下接種AMF和根瘤菌對(a)白三葉、(b)多年生黑麥草和(c)鴨茅菌根侵染率的影響

表3 不同播種方式及根瘤菌接種下白三葉、多年生黑麥草和鴨茅的菌根依賴性

2.5 不同播種方式下接種AMF和根瘤菌對植物地上部氮磷含量的影響

相比單播處理，混播中白三葉(P<0.05)和鴨茅(P<0.001)的地上部分氮含量顯著降低，但是接種AMF或根瘤菌對3種植物地上部的氮含量均無顯著影響(表1和圖6)。

混播中的白三葉和多年生黑麥草的地上部分磷含量顯著低于單播處理(P<0.05)，但是接種AMF后，3種植物地上部磷含量顯著高于不接種的對照(P<0.05)(表1和圖7)。

圖7 不同播種方式下接種AMF和根瘤菌對(a)白三葉、(b)多年生黑麥草和(c)鴨茅的植物磷的影響

2.6 菌根侵染率與生物量及地上部P含量的關系

白三葉的菌根侵染率與其地下生物量有顯著正相關關系(圖8a)，而2種禾草的菌根侵染率與其地上、地下生物量均無顯著相關性。另外，鴨茅的菌根侵染率與其地上部的磷含量呈顯著正相關關系(圖8b)，但白三葉與多年生黑麥草的根系菌根侵染率與各自地上部分氮、磷含量均無顯著相關性。

圖8 (a)白三葉根部菌根侵染率與地下生物量的關系；(b)鴨茅根部菌根侵染率與地上部磷含量的相關性

3 討論

3.1 AMF-根瘤菌對豆禾混播植物生長及種間關系的影響

本研究結果表明，3種植物混播時，白三葉的株高及地上地下生物量與單播相比顯著降低，但多年生黑麥草和鴨茅的株高及地上生物量與各自的單播對照相比顯著增加，這說明相比多年生黑麥草和鴨茅，白三葉在混播中處于競爭弱勢。但是，在混播中接種AMF之后，白三葉的株高及生物量大幅增加，而鴨茅和多年生黑麥草在群落中的比例顯著降低，說明接種AMF在3種植物混播時有助于增加白三葉的競爭力，對混播草地種間關系的調節起到非常關鍵的作用。無論單播還是混播，接種AMF均能與3種植物形成共生體。一定水平的氮可以促進AMF對寄主植物根系的侵染[32]，混播中白三葉通過固氮增加土壤中可利用的氮含量，使AMF在混播群落中發揮更大的作用。由于AMF與宿主植物之間存在一定的宿主偏好性[33]，導致在種植不同植物的土壤中AMF群落組成和數量存在差異，并進一步影響該種或者共存植物的生長，從而影響植物種間的相互作用[34-36]。前人研究表明，當草地群落中的優勢種為菌根依賴性較低的植物時，AMF的存在顯著增加了菌根依賴性強的亞優勢物種生長[37]。本研究結果與其一致，無論是否接種AMF，混播組中鴨茅均為優勢種，但接種AMF使鴨茅的相對生物量顯著降低，白三葉所占比例顯著提升。菌根依賴性的結果表明，白三葉的菌根依賴性最高，多年生黑麥草次之，鴨茅的菌根依賴性最弱，所以AMF可以調節3個物種種間關系。AMF的存在使得優勢種與亞優勢種的競爭關系趨于緩和，進而達到使群落內各物種生物量趨于均勻的效果，有利于混播草地群落的長期維持[38]。通常情況下，禾草對于土壤中養分及資源的競爭能力比豆科植物強，因此混播群落中的豆科植物會通過更強的AMF依賴性突破其養分需求的限制[39-40]。接種AMF增加了鴨茅的根冠比，調節了鴨茅體內碳從庫到源的流通分配過程。AMF對白三葉、多年生黑麥草的根冠比無顯著影響，主要因為根冠比受多種因素調控，如土壤水分、光照、礦質營養等原因[41]。在混播草地中，接種根瘤菌不僅對豆科植物的氮吸收具有重要意義，非豆科植物亦可通過其根系分泌物、根外菌絲網絡以及豆科植物腐爛的根系等途徑獲得豆科植物與根瘤菌共生所固定的氮[42-43]。根瘤菌在提高白三葉生物固氮的同時，提高了土壤中的可利用氮素，從而促進了多年生黑麥草和鴨茅的生長，有利于AMF對多年生黑麥草、鴨茅養分吸收的正向促進作用。本試驗中，接種根瘤菌顯著提高了白三葉的根冠比，但對白三葉的其他生長結瘤指標無顯著影響，而雙接種AMF和根瘤菌處理中，白三葉地下生物量及根部結瘤數均顯著高于其他接種處理。前人的研究表明，根瘤菌與豆科植物共生固氮是由根瘤菌菌株、寄主植株和環境條件共同調控的[44]，由于根瘤菌在土壤環境中的擴散較差[45]，而AMF產生的菌絲體可以協助根瘤菌轉移到根際，從而與宿主豆科形成根瘤[46]。此外，AMF和根瘤菌在信號傳導過程中存在著密切的聯系，在叢枝菌根共生體形成過程中釋放的一些信號物質是促進根瘤菌共生的關鍵結瘤因子，也是雙接種能顯著促進白三葉根系結瘤固氮的主要原因[47]。

3.2 AMF-根瘤菌對豆禾混播植物養分吸收的影響

混播中的白三葉和多年生黑麥草的地上部分磷含量顯著低于單播處理，但是接種AMF后，3種植物地上部磷含量顯著高于不接種的對照。由此可知，AMF可通過促進植物在群落中的養分吸收來調節植物種間關系。AMF可在低氮環境下促進植物對磷的吸收，與單播處理相比較，混播處理使白三葉和多年生黑麥草的植物磷含量顯著降低，主要是由較強的種間競爭引起混播物種間的養分不平衡性導致的，但是接種AMF緩解了這種競爭排除。一方面，接種AMF提升了植物根際土壤中的磷酸酶活性，增加了土壤中可利用磷含量，從而促進宿主植物對磷元素的吸收；另一方面，混播群落中的不同物種可通過土壤中的菌絲網絡進行養分傳輸，實現物種間養分利用的平衡[48-50]。盡管差異不顯著，接種AMF增加了白三葉地上部分的氮含量，主要是因為AMF可為白三葉的結瘤固氮提供更多的磷元素，解除了豆科生長的磷限制。白三葉在混播組合中可將固氮的氮傳遞給相鄰禾草，從而增加了禾草的可吸收氮素。

4 結論

本研究表明，接種AMF和根瘤菌對白三葉、多年生黑麥草和鴨茅的生長及種間關系有重要的調節作用。與未接種對照相比，接種AMF顯著促進了混播中白三葉的生長和結瘤數量，緩解了優勢物種鴨茅對白三葉、多年生黑麥草的競爭排除。同時接種AMF和根瘤菌為白三葉根部結瘤固氮創造有利的條件，而AMF的存在進一步降低混播植物間的種間競爭強度，對混播草地豆禾生產力及穩定性的維持起到顯著的作用。