華東地區掌葉覆盆子的表型特征和基于ISSR標記的遺傳分析△

孫健，任江劍a，華金渭，沈曉霞，王志安

1.浙江省中藥研究所有限公司，浙江 杭州 310023；2.麗水市農林科學研究院，浙江 麗水 323000

覆盆子為掌葉覆盆子RubuschingiiHu的干燥未成熟果實，具有益腎固精縮尿、養肝明目之功效[1]，臨床上常用于治療遺精滑精、遺尿尿頻、陽痿早泄、目暗昏花[2]，主要分布于我國華東地區的浙江、廣西、江西和福建等省。現代藥理研究表明，其具有抗腫瘤、抗氧化、調節血糖和血脂、抗衰老和抗炎等藥理作用[3-4]。分子鑒定技術在中藥材基原的區分和偽品鑒別中可以起到定性判別的作用[5]，其中以核糖體內部轉錄間隔區(ITS)序列和葉綠體psbA-trnH應用最多[6-7]。物種內部不同地理宗、居群或品種的區分需要更多的基因信息進行區分，對于無參考基因組的植物，往往采用隨機引物進行初步的研究，如相關序列擴增多態性(SRAP)、簡單重復間序列(ISSR)、擴增片段長度多態性(AFLP)等標記體系。其中，ISSR分子標記是全基因組多樣性分析的通用標記，具有多態性高、操作簡便等優點，至今仍用于植物群體遺傳組成的初步分析[8-11]。近年，浙江及周邊省份覆盆子產業發展迅速，人工引種栽培面積超過8萬畝(1畝≈666.67 m2)，而有關覆盆子資源的系統分析未見報道。本研究系統記錄了華東地區24份掌葉覆盆子資源的主要表型，利用ISSR標記對華東產區掌葉覆盆子與其近似種進行遺傳分析，明確了掌葉覆盆子與懸鉤子屬近緣植物紅樹莓R.idaeusL.、茅莓R.parvifoliusL.、山莓R.corchorifoliusL.f.、三花懸鉤子R.trianthusFocke、盾葉莓R.peltatusMaxim.的親緣關系和掌葉覆盆子種內的遺傳多樣性特征，為掌葉覆盆子的基原鑒定和新品種選育提供參考。

1 材料

1.1 樣品

2017年收集華東各地的野生掌葉覆盆子資源24份，收集近緣的懸鉤子屬植物5份。其中，1份樹莓樣品為國外引種的紅樹莓R.idaeus栽培種，山莓和茅莓采集自于杭州市西湖區，三花懸鉤子采集于臺州市石梁鎮，盾葉莓采集于杭州市藻溪鎮。各樣品統一栽培于麗水市農科院試驗基地。2019年開花后，植物基原由麗水市農林科學研究院華金渭研究員鑒定，結合花器官表型[12]和ITS序列信息(分子鑒定參考呂群丹等[13]方法)鑒定為掌葉覆盆子RubuschingiiHu、紅樹莓R.idaeusL.、茅莓R.parvifoliusL.、山莓R.corchorifoliusL.f.、三花懸鉤子R.trianthusFocke、盾葉莓R.peltatusMaxim.。24份掌葉覆盆子材料來源和表型見表1。

表1 掌葉覆盆子來源和表型特征

1.2 試藥

聚合酶鏈式反應(PCR)擴增試劑為2×HieffTMPCR Plus Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司)。三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、β-巰基乙醇、三氯甲烷、異戊醇均為分析純，均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器

Veriti 96 Well Thermal cycler型PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；Gel DocTMXR+型凝膠成像儀、PowerPac Basic型電泳儀(美國Bio-Rad Laboratories公司)；Legend Micro 17型高速離心機(美國Thermo公司)；M200 Pro型多功能酶標儀(美國Tecan公司)；Tissue Lyser Ⅱ型組織研磨器(德國Qiagen公司)。

2 方法

2.1 表型記錄

參考同屬植物樹莓和月季的表觀性狀分類體系[14-15]，結合掌葉覆盆子生物學特征，選取8個表觀性狀進行觀察記錄。每份樣品隨機選取5個單株，群體內質量性狀出現變異的以多數個體表現的性狀為準。于2019年3月觀察孕蕾期2年生枝條主干的顏色，定義莖干顏色為綠色和紅色；統計2年生枝條主干離地40～55 cm處皮刺數量(N)，定義皮刺密度為密集(N≥30)、中等(30>N≥15)、稀疏(N<15)3個級別；定義葉形為7裂葉、5裂葉2種；根據果期幼葉尖端是否為紅色，定義幼葉色苷類型為有、無 2種；定義花瓣基部至外緣頂端的距離為花瓣長；定義連接枝干和果實之間的果柄的距離為果柄長；根據果實頂端型態，定義果型為漸尖、截平2種類型；定義藥材采收期，即綠轉黃期果實的干質量為果質量。

2.2 ISSR標記擴增

每份樣品隨機選取嫩葉10片，采用十六烷三甲基溴化胺(CTAB)法提取樣品材料中的基因組DNA，用1×TE緩沖液調整其質量濃度為100 ng·μL-1。擴增反應體系為基因組DNA模板1 μL(約100 ng)、引物1 μL(10 μmol·L-1)、MgCl2溶液(25 mmol·L-1)1 μL、Mix-Taq10 μL和ddH2O 7 μL，總體積為20 μL。擴增程序為94 ℃預變性4 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環；72 ℃延伸7 min。以24份樣品等量混樣提取的總DNA為模板，采用ISSR引物進行多態性篩選。ISSR標記引物為加拿大哥倫比亞大學公布的引物。以ISSR引物分別擴增PCR產物，PCR產物在含有染料的2%瓊脂糖凝膠中電泳后用成像儀拍照，引物序列見表2。

表2 ISSR標記及其擴增結果

2.3 數據分析

應用SPSS 16.0軟件，將表觀性狀數標準化處理后進行相關性分析和聚類分析；應用POPGENE 1.32軟件對ISSR條帶數據的遺傳多樣性進行分析；應用NTSYS-pc 2.10軟件基于UPGMA方法，構建聚類樹狀圖。

3 結果

3.1 掌葉覆盆子表型特征分析

24份掌葉覆盆子資源來源覆蓋覆盆子的主產區。結果表明，掌葉覆盆子表型豐富，8個表觀性狀包括5個質量性狀和3個數量性狀。掌葉覆盆子的藥材采收期為處于青色轉黃時期的未成熟果實[16]，記錄藥材采收期的果干質量。相關性分析表明，花瓣長度和產量性狀果質量有正相關關系，其他性狀之間沒有顯著的相關性(表3)。由于花瓣長和果質量性狀間有相關關系，且果質量為果實快速發育期性狀，因此，基于表型性狀的聚類分析，選用了莖干顏色、皮刺密度、葉形、幼葉色苷、花瓣長、果柄長、果型7個性狀。聚類結果顯示，上述7個表觀性狀可以較好地區分和描述華東地區的掌葉覆盆子資源(圖1)。同時，基于7個表觀特征數據的聚類結果分析，表型特征與地域分布無關。對比分子數據聚類結果沒有呈現出顯著的區域間表型分化。

圖1 基于表型數據的掌葉覆盆子聚類分析圖

表3 掌葉覆盆子表型性狀間相關性

3.2 ISSR標記擴增產物多態性分析

應用8條擴增譜帶清晰并呈多態性的ISSR引物(圖2)對29份材料進行擴增，對24份掌葉覆盆子資源的標記多態性進行統計，共檢測到90個位點。其中，多態性位點58個，占比64.44%(表2)。

注：M.DNA Maker；1～24.掌葉覆盆子樣品的帶型；25～29.山莓、茅莓、三花懸鉤子、紅樹莓和盾葉莓樣品的帶型。

3.3 遺傳距離和聚類分析

本研究中，掌葉覆盆子種質資源間的遺傳相似系數為遺傳相似系數為0.536 6～0.878 0，平均值為0.715 7。其中，遂昌和南屏的材料遺傳相似性系數最低，為0.536 6；臨岐和建德的材料遺傳相似性最高，為0.878 0。該結果表明，本研究中掌葉覆盆子材料的整體遺傳相似性較大，來自不同地域的材料也存在較大的差異。應用NTSYS-pc軟件分析供試材料間的遺傳相似系數，基于UPGMA方法，構建聚類樹狀圖(圖3)。本研究的公示材料均為ISSR標記信息，可以明確區分掌葉覆盆子與近緣懸鉤子植物，懸鉤子屬(Rubus)空心莓組(Sect.Idaeobatus)植物，山莓和三花懸鉤子與掌葉覆盆子均為單葉，且花著生于小枝頂部，屬于球果亞組(Subsect.Corchorifolii)，聚類的親緣關系較近；紅樹莓和茅莓均為復葉，分屬于絨毛葉亞組(Subsect.Stimulantes)和傘房花序亞組(Subsect.Idaeanthi)，兩者遺傳距離較近；而盾葉莓屬于盾葉亞組(Subsect.Peltati)，為單生葉，聚類于茅莓與球果亞組植物之間。在相似系數為0.67～0.70處24份掌葉覆盆子資源又可進一步聚為浙北、浙南和閩北3組，說明不同地域的掌葉覆盆子出現了一定的遺傳分化。以浙北、浙南和閩北為群體，應用POPGEN軟件，進一步分析可知區域間群體的遺傳距離<0.253 8、遺傳一致度>0.775 9、基因分化系數(Gst)為0.320 3、基因流(Nm)為1.061 2，說明3個區域群體間的遺傳分化不明顯。

圖3 基于ISSR標記信息的掌葉覆盆子與近緣植物聚類分析圖

3.4 遺傳多樣性分析

在物種水平上，掌葉覆盆子的基因多樣性指數(H)=0.272 0、Shannon′s信息指數(I)=0.412 7(表4)，說明該物種的基因遺傳多樣性較高。浙南地區的掌葉覆盆子H高于浙北地區，而I低于浙北區域。該結果可解釋為浙北地區每份資源平均的基因多樣性較高，而浙南地區不同材料間的有效等位基因數差異較大。閩北地區的供試的材料數量較少，導致H和I較低，不能顯示區域內物種的遺傳多樣性，需要加大樣本做進一步研究。

表4 基于ISSR標記信息的掌葉覆盆子遺傳多樣性參數

4 討論

4.1 藥用覆盆子的種源引種與選育

從物種基原的水平上分析，中藥材覆盆子基原植物呈現逐漸純化的過程。傳統中藥材覆盆子來源豐富，歷史上諸多薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus)植物的果實被當作“覆盆子”入藥，傳統醫藥書籍中記載的覆盆子基原植物名稱有“蓬藟”“插田泡”“茅莓”“覆盆子”“黃果懸鉤子”“寒莓”等，隨時間推移，醫家逐漸明確“覆盆子”為植物掌葉覆盆子的未成熟干燥果實[17]。目前，《中華人民共和國藥典》2020年版收錄的覆盆子的基原植物也只有掌葉覆盆子[3]。本研究的全基因組的分子標記研究表明，掌葉覆盆子與近緣的懸鉤子屬植物有明顯的物種分化。與此同時，掌葉覆盆子相對于其他懸鉤子屬近緣植物的藥理效果系統評價還有待進一步研究。本研究基于ISSR標記信息對物種的區分與聚類結果與Yan等[18]基于葉綠體基因(rbcL、rpl20-rps12、trnG-trnS)和核基因(ITS、GBSSI-2、PEPC)的懸鉤子屬植物聚類結果是一致的，表明ISSR標記體系可以較好地區分懸鉤子屬近緣植物。目前，掌葉覆盆子已經形成了一定的種植規模，其種植模式仍處于原地野生資源引種繁育階段，還沒有穩定的優質藥用品種育成。綜上所述，掌葉覆盆子的ISSR標記基因多樣性較高、種質區分性較好、研究效率高，可以運用于種質區分和遺傳研究工作。

4.2 掌葉覆盆子的遺傳結構與分化

掌葉覆盆子物種水平上H=0.272 0、I=0.412 7，高于瀕危植物五小葉槭[19]、稀有藥用植物滇重樓[20]、已經馴化的植物黃瓜[21]，與華南廣布的華中五味子相當[22]，表現出中等偏高的遺傳多樣性。植物種群的遺傳多樣性變化與物種自身的繁育系統、遺傳漂變、基因突變，以及外部環境變化、人類活動導致的種群隔離和生境片斷化、異地引種等諸多因素相關[23-24]。華東地區掌葉覆盆子整體呈現出較高的遺傳多樣性，該結果與掌葉覆盆子為蟲媒花、生長年限久、可以依靠鳥類長距離傳播等生物特征相關。與此同時，聚類分析結果顯示，在遺傳相似系數0.67～0.70處，供試樣品呈現出區域分化的現象，導致該現象的原因可能與不同緯度地區群體的花期不遇，生長區域因人為活動產生隔離等原因相關。雖然，掌葉覆盆子的野生群體具有較高的遺傳多樣性，但是在掌葉覆盆子的引種馴化過程中，往往采用根蘗芽無性繁殖，該操作導致基因多樣性的下降，進而加大病蟲害大規模爆發的風險[25-26]。因此，在發展掌葉覆盆子產業的同時，應注意保護野生掌葉覆盆子資源，同時注意引種資源的品種更新。