紫癜性腎炎患兒血清sFlt-1、vWF水平變化及其意義

代彥林，張霞，高敏，韓姍姍，，丁櫻，

1河南中醫藥大學，鄭州450000；2河南中醫藥大學第一附屬醫院

紫癜性腎炎（HSPN）是最常見的繼發性腎小球疾病，是影響過敏性紫癜（HSP）患兒病程及預后的重要因素［1-2］。HSPN臨床表現多樣，可表現為急進性腎炎、急性腎炎、腎病綜合征、急性腎功能損傷等多種類型，腎臟病理表現為以IgA系膜區沉積為主的系膜增生性腎小球腎炎［3］。HSPN是自限性疾病，以往認為患者預后良好，但長期隨訪發現3%～7%的患兒數年后發生更嚴重的腎損害，甚至進展為終末期腎病［4］，嚴重影響患兒生活質量，威脅患兒生命健康。HSPN生理、病理過程復雜，發病機制迄今尚未完全闡明，目前普遍認可的是異常糖基化的IgA1，IgA1形成的免疫復合物沉積于機體小血管壁，通過激活補體系統、凝血途徑、炎癥反應等引起小血管壁損傷［5］。費文君等［6］發現，用熱聚合的HSP患者血清中IgA1刺激人臍靜脈內皮細胞12 h，可促進內皮細胞IL-8、TNF-α、NO釋放以及NF-κB表達，從而損傷內皮細胞。故而內皮損傷在HSPN的發病及進展中有重要意義，及時了解內皮損傷程度，并做出對應處理，在減緩HSPN疾病進展中有積極作用。可溶性血管內皮生長因子受體1（sFlt-1）作為血管內皮生長因子（VEGF）的可溶性抗體［7］，能夠結合VEGF，拮抗其營養功能引起內皮細胞損傷，是導致內皮功能障礙的重要因子。vWF是由血管內皮細胞合成的一種具有黏附功能的大分子糖蛋白，主要功能是介導血管內皮損傷后的初始血小板黏附、聚集。內皮細胞損傷、異常活化時vWF在30 min內快速釋放入血，因此vWF被作為內皮細胞損傷標志物［8］。本研究觀察了HSPN患兒血清中sFlt-1、vWF的水平變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年4月—2019年4月河南中醫藥大學第一附屬醫院收治的HSPN患兒45例，男30例，女15例；年齡4～17（9.36±3.00）歲。納入標準：①HSPN臨床診斷符合《紫癜性腎炎的診治循證指南（2016）》的相關診斷標準［3］，且臨床分型符合血尿和蛋白尿型或者孤立性蛋白尿型；②年齡2～18歲；③1周≤HSPN病程≤8周；④針對尿檢異常未使用過腎上腺皮質激素、環磷酰胺、雷公藤多苷、霉酚酸酯等免疫抑制劑；⑤患兒或其監護人同意并簽署知情同意書。排除標準：①除HSP外其他疾病導致的腎臟損傷；②持續高血壓或腎氮質血癥者；③系統性紅斑狼瘡、血管炎、病毒性肝炎（丙肝、乙肝等）、高尿酸血癥等所致的腎損害；④對本方案中藥物成分過敏者；⑤不符合以上西醫診斷標準，臨床類型屬孤立性蛋白尿或血尿和蛋白尿型以外類型。另選同期收治的HSP患兒15例，男10例，女5例；年齡6～16（10.22±2.32）歲。納入標準：①符合2013年《兒童過敏性紫癜循證診治建議》的診斷標準［5］；②年齡在2～18歲；③未使用昆仙膠囊及雷公藤多苷片等免疫抑制劑）；④無腎臟損傷表現（血尿、蛋白尿）。同期健康體檢兒童15例，男9例，女6例；年齡5～15（10.31±2.14）歲。納入對象一般資料無統計學差異，具有可比性。本研究經本院倫理委員會審批，且所有兒童及其監護人已同意并簽署知情同意書。

1.2 血清sFlt-1、vWF檢測方法 經患兒及監護人同意，由護士抽取HSPN患兒、HSP患兒、健康體檢兒童晨起空腹靜脈血3 m至無菌抗凝管中，室溫靜置30 min后以3 000 r/min離心5 min，于EP管分裝后置于－80℃冰箱冷存備用，同時收集記錄HSPN患兒的臨床及實驗室資料。嚴格按照試劑盒說明書，用ELISA法同批檢測所有血清樣本sFlt-1、vWF水平。在sFlt-1、vWF細胞檢測板中加入對應濃度的待測品（稀釋30倍）和標準對照品，加入酶標試劑，封板膜封板后置37℃恒溫箱孵育30 min，洗板5次后依次加入相應的顯色劑進行顯色反應，最后利用終止劑對反應進行終止，并利用酶標儀在450 nm波長處測出各孔OD值，繪制出標準曲線圖并計算出兩細胞因子的水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS23.0統計軟件。計量資料以xˉ±s表示，組間比較采用單因素方差分析；相關性分析采用Pearson相關分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清sFlt-1、vWF水平比較 血清sFlt-1、vWF水平比較見表1。

表1 各組血清sFlt-1、vWF水平比較（±s）

表1 各組血清sFlt-1、vWF水平比較（±s）

注：與對照組比較，△P＜0.05；與HSP組比較，▲P＜0.05。

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2.2 HSPN組血清sFlt-1與vWF水平的相關性HSPN組血清sFlt-1與vWF水平無相關性（r=-0.24，P=0.180）。

3 討論

HSPN是兒童常見的一種繼發于HSP的腎小球疾病，發病誘因涉及感染、藥物反應、免疫紊亂［9-10］等，其發病機制尚未有統一定論，目前公認的是IgA異常糖基化形成的免疫復合物沉積于機體小血管壁，尤其是腎毛細血管叢而引起一系列炎性反應造成小血管壁損傷［5］。當機體對沉積于血管壁上的免疫復合物出現清除障礙時，可通過血管內皮細胞（VEC）主動轉運功能以及巨噬細胞對Fc受體依賴的攝取功能，使IgA1形成的免疫復合物沉積于腎小球毛細血管叢，引起腎小球內皮細胞（EC）損傷［11-12］，進而出現血尿、蛋白尿等HSPN的典型癥狀；EC損傷，組織因子暴露于血液并與FVII或FVIIa結合，進而激活凝血系統，損傷的EC可釋放Ⅷ因子相關抗原促進血小板黏附于血管內膜，導致腎小球局部微循環內凝血，加重小球內纖維蛋白沉積、微血栓形成，腎血流減少，則進一步加重腎損害，在腎臟活檢中常發現毛細血管內血栓形成以及纖維蛋白沉著。祝旭飛等［13］發現，根據血管內皮病變情況進行腎臟病理分類，能夠更準確地反映HPSN患者腎臟損傷程度，及早提示腎小球病變。

sFlt-1是由Flt-1蛋白的胞外前6個結構域加上1個特異性31氨基酸尾部組成，主要在內皮細胞、近端腎小管細胞、胎盤等部位分泌，以游離形式存在，可通過結合VEGF，拮抗其營養功能而引起內皮細胞損傷。sFlt-1由Flt-1胞外域剪接而成，與VEGF有高親和力特性，并且能與VEGF的兩個表面受體VEGFR-1、VEGFR-2形成同源或異源二聚體，從而阻斷VEGF的生物學活性，抑制其促有絲分裂作用，sFlt-1的拮抗作用幾乎能夠全部抑制VEGF引起的內皮細胞增殖活動，從而導致血管生成障礙以及影響血管壁的完整性和通透性［14］。FAILLA等［15］發現，sFlt-1能夠破壞血管生成平衡機制，降低血管生成活性，損傷血管的修復機制，從而導致內皮損傷以及蛋白尿的排出。SUGIMOTO等［16］給予正常小鼠sFlt-1，3 h后可出現明顯的蛋白尿，24 h內觀察到腎臟病理出現一系列的改變，包括內皮細胞腫脹、細胞內空泡形成與裂解，臟層上皮細胞的損害和脫落，內皮細胞與基底膜分離等。WEWERS等［17］發現，在腎移植4個月內接受腎活檢的25例參與者中，血清sFtl-1水平升高患者腎小管周毛細血管面積較小。將重組sFlt-1注入嚙齒動物中會導致腎臟微血管的結構以及功能變化，包括腎小管周圍毛細血管密度降低，毛細血管內血容量減少，炎癥基因表達增加，以及腎小球纖維化增加。因此，sFlt-1作為VEGF的可溶性受體是導致內皮細胞損傷的重要因子之一。

vWF是由內皮細胞和巨核細胞合成的一種大分子蛋白多聚體，其絕大部分是由血管內皮細胞合成，在靜息狀態下以二硫鍵相連的多聚體形式儲存在內皮細胞的棒管狀小體（WPB）中，生理狀態下血漿中vWF的含量較少，當內皮細胞損傷、異常活化時，vWF可以在30 min內被釋放入血液循環，快速吸附至損傷位點，通過多種分子機制促使血小板黏附于損傷的內皮下層，誘導血小板進一步聚集和黏附［18-19］，隨后更多的血小板聚集，逐漸形成血栓，沉積于毛細血管，引起局部組織缺血和低灌注。vWF的產生幾乎全部來自于血管內皮細胞，其變化能夠敏感反映內皮細胞損傷、異常活化以及功能障礙等，是目前公認的有價值的內皮損傷標志［20］。MEIR?ING等［21］用IL-6、IL-8、TNF-α、組織因子（TF）、凝血酶刺激療HUVEC，靜態條件下觀測24 h，發現除了IL-6，其他因子及它們的組合均能顯著刺激HUVEC的vWF的分泌。劉沨等［22］對62例HSPN患者血清進行檢測，發現HSPN患者血清vWF水平高于對照組，且與蛋白尿水平以及腫瘤壞死因子相關。綜上，血清sFlt-1、vWF血管活性物質的檢測可以比較敏感地反映血管內皮的病變，能夠一定程度上反映內皮細胞的損傷。

本研究顯示，HSPN患兒血清sFlt-1、vWF水平明顯高于HSP患兒及健康體檢兒童，HSP組患兒血清sFlt-1、vWF的水平高于對照組兒童，提示sFlt-1、vWF可能參與了HSPN的發病進程，且導致或加重HSP以及HSPN中內皮損傷［22］。本研究還發現，HSPN患兒血清sFlt-1水平與vWF水平無相關性，目前在HSPN方面尚無此類研究，所以無法進行比較驗證，由于IgAN和HSPN具有相似的腎臟病理表現和免疫學改變，目前被多數專家認為是同一種疾病的不同表現。研究發現，IgAN患者血清sFlt-1與vWF呈正相關，這與本研究結果不一致，我們考慮以下幾點原因：①HSPN與IgAN發病機制并非完全相同，HSPN中除外內皮生成、破壞不平衡外，尚有其他機制存在，具體機制尚需要我們進一步去探索；②研究對象不同，本項研究中所有研究對象均為兒童，而ZHAI等的研究對象為成年人；③樣本量過少，本次實驗由于時間以及病例要求的嚴格性，只納入了45例合格病例。

總之，HSPN患兒血清sFlt-1、vWF水平升高，兩者可能參與HSP早期腎臟損傷。