捻轉血矛線蟲Hc-hrg-2拯救血紅素缺陷型酵母生長表型

周靜茹，吳飛，陳學秋，黃艷，時恒枝，杜愛芳，楊怡

捻轉血矛線蟲拯救血紅素缺陷型酵母生長表型

周靜茹，吳飛，陳學秋，黃艷，時恒枝，杜愛芳，楊怡

浙江大學動物科學學院/浙江省動物預防醫學重點實驗室，杭州 310058

【】已有研究表明捻轉血矛線蟲（）屬于血紅素應答基因，高濃度血紅素的刺激可導致該基因的轉錄水平上調，但其在血紅素調控中的功能尚缺乏研究。研究通過同源重組技術構建血紅素合成缺陷型釀酒酵母（）敲除株，通過異源表達對該敲除株進行表型拯救試驗，以期驗證參與細胞內血紅素轉運的功能。以BY4741基因組為模板，設計引物，擴增獲得（SGD:S000002640）基因序列5'和3'側翼區同源臂；同時以pYES2-CT質粒為模板設計引物，擴增獲得篩選標記URA3序列；利用兩次重疊PCR技術依次將測序正確的上游同源臂、URA3、下游同源臂序列串聯成基因敲除組件，并通過醇沉法對敲除組件進行純化。采用醋酸鋰轉化法將純化的敲除組件轉化至BY4741感受態細胞中, 經SD/- URA（含250 μmol·L-15-氨基乙酰丙酸（ALA））培養基篩選，并利用多對引物進行PCR鑒定，以驗證敲除株的正確性。同時以含有浙江株序列（GenBank：MK371241）及其功能域缺失序列和的質粒為模板，利用特異性引物分別進行PCR擴增，通過無縫克隆將擴增得到的目的片段插入酵母pESC-LEU表達載體，經PCR鑒定以及測序驗證后，采用醋酸鋰轉化法將正確的表達載體轉化至感受態細胞中，通過SD/- URA/- LEU（含250 μmol·L-1ALA）培養基篩選以及PCR鑒定驗證陽性異源表達株的正確性。通過比較敲除株及其各異源表達株在含有或不含有250 μmol·L-1ALA的SD/- URA/- LEU液體培養基中的生長情況，進一步驗證敲除株的表型同時排除表達載體對表型的影響。用2%半乳糖對含有陽性表達質粒的敲除株進行誘導，取部分菌液進行超裂破碎，收集蛋白，通過Western Blot鑒定目的蛋白的表達；剩余菌體用去離子水重懸至OD600= 0.2，用去離子水進行5倍比稀釋，取4 μl稀釋后的菌液點至含有250 μmol·L-1ALA或者不同濃度血紅素的誘導平板上，28℃培養2—3 d后比較敲除株的生長情況。成功獲得基因敲除株，與野生株相比，不能合成血紅素，需外源添加ALA（250 μmol·L-1）或血紅素（≥ 10 μmol·L-1）才能生長，且異源表達株和敲除株的表型一致。Western Blot結果表明2%半乳糖能誘導及其功能域缺失基因在敲除株中成功表達，且表達能夠在低血紅素濃度下（≤ 1 μmol·L-1）促進酵母對血紅素的攝取，拯救敲除株的生長缺陷，其硫氧還蛋白樣結構域（GST-N）和谷胱甘肽S-轉移酶C末端結構域（GST-C）的缺失會降低拯救的效果。捻轉血矛線蟲血紅素應答基因可促進細胞對血紅素的攝取，其GST-N和GST-C功能域在該過程中發揮著重要作用，研究成果為后續深入研究捻轉血矛線蟲的血紅素轉運機制奠定基礎。

捻轉血矛線蟲；血紅素；；釀酒酵母；敲除株；異源表達；拯救

0 引言

【研究意義】捻轉血矛線蟲（）是世界分布的具有重大經濟意義的反芻動物寄生性線蟲[1]，嚴重地區感染率可達100%[2]。該線蟲寄生宿主皺胃以吸食血液為生[3-4]，可引起宿主消化不良，貧血及貧血綜合征，嚴重影響宿主的健康[5-6]。目前捻轉血矛線蟲病的防控主要以藥物使用為主，隨著耐藥問題日益嚴重，迫切需要新型抗線蟲藥物緩解現狀[7-9]。血紅素作為多種蛋白質的輔助因子，在能量代謝、氧氣運輸和存儲、細胞色素依賴性的電子轉運等生物學過程中發揮重要作用[10]。然而，包括捻轉血矛線蟲在內的絕大多數線蟲（營自由生活和寄生）都缺乏完整的功能性血紅素生物合成途徑，需要攝取和利用源自于宿主的血紅素[11]。因此，合理調控血紅素的攝取及轉運對寄生蟲的生存和繁殖至關重要，探明該機制可能為尋找藥物潛在靶標提供依據。【前人研究進展】作為一種自由生活的血紅素缺陷型線蟲，秀麗隱桿線蟲（）是研究血紅素依賴性信號通路的最佳模式生物，在血紅素轉運機制研究上取得了很多進展。通過轉錄組分析、RNAi篩選和表型分析，目前已經鑒定了幾種介導腸細胞血紅素攝取以及胞內胞間血紅素轉運的蛋白質如Ce-HRG-1、HRG-2、HRG-3、HRG-4、MRP-5、HRG-7等[12]，為寄生性線蟲的相關研究奠定了重要基礎。介于生活史的復雜性和研究手段的局限性，寄生性線蟲血紅素攝取和轉運機制的研究相對滯緩。目前研究明確了巴西日圓線蟲（）和馬來絲蟲（）對宿主血紅素的攝取和利用，并且對馬來絲蟲中Ce-HRGs的同源物BmHRG-1、BmHRG-2和BmMRP-5進行了功能探究[13-14]。同時已有研究通過高通量液相質譜-串聯質譜技術（High throughput LC-MS/MS）對捻轉血矛線蟲排泄分泌蛋白質組進行分析，推測其體內存在由天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶以及外肽酶構成的蛋白酶水解級聯體系，該體系能參與血紅蛋白的降解[15]。血紅素作為血紅蛋白的重要組成部分，血紅蛋白的降解必然伴隨著血紅素的產生[16]。但是目前捻轉血矛線蟲血紅素轉運相關的研究甚少。本研究團隊前期對捻轉血矛線蟲中Ce-HRG-2的同源物Hc-HRG-2進行了功能探究，結果表明Hc-HRG-2作為內質網膜蛋白，能夠在體外與血紅素結合并抑制蛋白的GST酶活性[17]。在多細胞生物中對單個基因進行功能研究時往往會受到其旁系同源物的干擾，因此在血紅素合成缺陷型釀酒酵母（）基因敲除株中對寄生蟲血紅素轉運相關基因進行功能驗證得到了廣泛運用，目前已經成功運用于秀麗隱桿線蟲、利什曼原蟲（）、克魯氏錐蟲（）、曼氏血吸蟲（）等[18-21]。【本研究切入點】前期研究表明，屬于血紅素應答基因，其蛋白具有血紅素結合特性。本研究擬通過構建血紅素合成缺陷型釀酒酵母基因敲除株，驗證捻轉血矛線蟲參與細胞內血紅素轉運的生物學功能。【擬解決的關鍵問題】構建血紅素缺陷型釀酒酵母敲除株，異源表達進行酵母生長拯救試驗，并探明其發揮作用的關鍵功能域，以期為進一步研究參與調控捻轉血矛線蟲血紅素穩態的相關機制奠定基礎。

1 材料與方法

試驗于2019 年 4月至 2020 年 1月在浙江大學預防獸醫研究所寄生蟲病理生物學研究室進行。

1.1 菌株與質粒

釀酒酵母菌株BY4741購自德國EUROSCARF，大腸桿菌（）菌株TOP10由浙江省動物預防醫學重點實驗室制備并保存；質粒pYES2-CT（攜帶URA3篩選基因）和pESC-LEU （攜帶LEU篩選基因和GAL1啟動子）購自淼靈質粒平臺，質粒 pMD19-T vector 購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試劑與試劑盒

LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、各種限制性內切酶購自寶生物工程（大連）有限公司。高保真性KOD-FX PCR酶購自東洋紡（上海）生物科技有限公司。NovoRec Plus PCR一步定向克隆試劑盒購自上海近岸科技有限公司。質粒抽提試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒均購自浙江易思得生物科技有限公司。

酵母YPD培養基、葡萄糖、瓊脂粉購自生工生物工程（上海）股份有限公司；篩選培養基SD/- URA和酵母轉化試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；酵母氮源基礎培養基（YNB）、Minimal SD Base Gal/Raf培養基以及缺陷型氨基酸DO Supplement -Leu/-Ura購自北京酷來博科技有限公司；酵母基因組提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

5-氨基乙酰丙酸（ALA）、血紅素和抗Flag標簽鼠源單克隆抗體購自Sigma公司，DNA提取酚試劑購自索萊寶試劑平臺，苯甲基磺酰氟（PMSF）、二硫蘇糖醇（DTT）和HRP標記的山羊抗鼠IgG購自杭州弗德生物科技有限公司。

1.3 引物設計與合成

根據釀酒酵母基因組數據庫（Saccharomyces genome database）中（SGD:S000002640）及其5' 和3' 側翼區序列設計敲除引物；根據圖1，設計鑒定酵母敲除株的引物。以pESC-LEU為載體，設計構建表達質粒的引物。所有引物的合成和測序均有浙江易思得生物科技有限公司完成，引物序列見表1。

A和B位于hem15'和3'側翼區（FR）的兩側；C、D、E、F位于ORF上；G、H、I、J位于篩選標記URA3上

表1 本試驗所用的引物序列

加粗：的部分序列；下劃線加粗：全序列；小寫字母：PESC-LEU載體的部分序列

Bold: partial sequence of; Underlined bold: full sequence of; Lowercase letters: partial sequences of the PESC-LEU vector

1.4 酵母hem1敲除組件的構建

以BY4741基因組為模板，采用引物5' FR-F/R、3' FR-F /R（5' FR-R和3' FR-F含18 bp序列）分別進行PCR擴增，獲得的上下游同源臂序列。以質粒pYES2-CT為模板，用引物URA3-F/R（上下游引物含方向相同的序列）進行PCR擴增，獲得篩選基因URA3序列。分別利用引物5' FR-F /URA3-R和5' FR-F / 3' FR-R，通過兩次重疊PCR技術依次將上游同源臂、URA3、下游同源臂序列串聯成基因敲除組件，總長度為3 088 bp。普通PCR擴增的條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min。第一次重疊PCR擴增的條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25個循環；72 ℃ 10 min。第二次重疊PCR擴增的條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25個循環；72 ℃ 10 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收目的片段，連接至 pMD19-T載體，再將連接產物轉入TOP10 感受態細胞中，菌液 PCR 鑒定陽性菌落，將陽性菌液送至浙江易思得生物科技有限公司測序分析。

以測序正確的pMD19-T-基因組敲除組件質粒為模板，用高保真KOD-FX酶進行PCR擴增（100 μL體系），PCR條件：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，30個循環。按照PCR產物﹕DNA提取酚試劑﹕氯仿 = 2﹕1﹕1的比例（體積比），劇烈混勻，12 000′離心10 min，取最上層上清。按照上述步驟重復一次。上清用1/10 體積的3 mol·L-1醋酸鉀（pH 5.5）溶液和2.5倍體積的無水乙醇在-20℃條件下沉淀1 h，12 000′離心10 min，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌一次，開蓋風干，用20 μL去離子水溶解備用。

1.5 酵母hem1敲除株的篩選與鑒定

制備釀酒酵母BY4741感受態細胞，利用醋酸鋰轉化法轉化1 μg敲除組件片段到50 μL BY4741感受態細胞中[22]。轉化后的菌液涂在含有250 μmol·L-1ALA的SD/-URA平板上，28℃培養2—3 d，將單菌落在含有250 μmol·L-1ALA的SD/-URA平板上劃線，28℃培養2—3 d，挑選單克隆接種含有250 μmol·L-1ALA的SD/-URA液體培養基中，30℃，200 r/min，搖床培養2 d，收集菌體。利用基因組提取試劑盒提取菌體DNA基因組作為模板，用引物A-B、C-D、A-E、F-B、G-H、A-I、J-B進行PCR驗證，PCR條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 4 min，30個循環；72℃ 10 min。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析并將條帶回收送至浙江易思得生物科技有限公司測序。

1.6 酵母表達載體構建和表達株的表型鑒定

以含有捻轉血矛線蟲ZJ株基因序列（GenBank number: MK371241）及其功能域缺失序列和的質粒為模板[17]，分別以-F/R為引物，用KOD-FX酶進行PCR擴增；同樣地，以秀麗隱桿線蟲的cDNA為模板，用-F/R引物進行PCR擴增獲得參與腸道血紅素攝入的序列（WBGene00009493），上述PCR條件：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，30個循環。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收目的片段。酵母表達載體pESC-LEU經限制性內切酶Not I單酶切后經1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收載體片段。目的片段和載體片段用無縫克隆試劑盒連接，轉入TOP10 感受態細胞中，菌液 PCR 鑒定陽性菌落，將陽性菌液送至浙江易思得生物科技有限公司測序分析。

用質粒回收試劑盒提取測序正確的陽性菌質粒，制備酵母感受態，利用醋酸鋰轉化法轉化1 μg質粒到50 μL感受態細胞中, 轉化后的菌液涂在含有250 μmol L-1ALA的SD/-URA/-LEU平板上，28 ℃培養2—3 d，挑選單克隆直接用通用引物pESC-F/R進行PCR鑒定。PCR條件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，37個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，有目的帶的均為含有表達質粒的陽性克隆。

將鑒定成功的轉化子用牙簽蘸取少許分別接種到3 mL含有或不含有250 μmol L-1ALA的SD/-URA/ -LEU液體培養基中，30 ℃，200 r/min，搖床培養2 d，拍照記錄轉化子在兩種培養基中的生長情況。

1.7 斑點生長試驗

參照YUAN等的方法[23]，對該試驗進行了優化，具體步驟如下：將含有表達質粒的陽性克隆接種到5 mL含有250 μmol·L-1ALA的SD/-URA/-LEU液體培養基中，30 ℃，200 r/min，搖床培養2 d，收集菌體，接種部分菌體到5 mL含有250 μmol·L-1ALA的SD(Gal/Raf)/-URA/-LEU液體培養基（不含葡萄糖）中，使得OD600= 0.4，30℃，200 r/min，搖床培養24 h，誘導酵母表達目的蛋白。收集菌液，用5 mL SD (Gal/Raf)/-URA/-LEU液體培養基（不含葡萄糖）重懸，30 ℃，200 r/min，搖床培養18 h（耗盡酵母本身含有的血紅素）。菌體用去離子水重懸至OD600= 0.2，用去離子水進行5倍比稀釋，取4 μL稀釋后的菌液點到含有250 μmol·L-1ALA或者不同濃度血紅素 (0、0.04、0.1、1、10 μmol·L-1) 的SD(Gal/Raf)/-URA/ -LEU固體平板上，28 ℃培養2—3 d后，拍照記錄酵母生長狀況，根據斑點的數目比較生長狀況，斑點數相差N個，則生長倍數相差5N倍。

1.8 誘導表達目的蛋白的鑒定

斑點生長試驗多余的菌體用1 mL PBS緩沖液重懸，加入蛋白酶抑制劑PMSF（1 mmol·L-1）和二硫蘇糖醇DTT（1 mmol·L-1），用超裂儀超裂破碎，45%功率，工作2 s / 間隔1.5 s，4 ℃超裂40 min，12 000′離心10 min，收集溶解于PBS中的蛋白；沉淀用8 mol·L-1尿素溶解，12 000′離心10 min，收集溶解于尿素中的蛋白。將上述兩種蛋白混合后，進行SDS-PAGE電泳，轉印到NC膜上，以mouse anti-flag tag（1﹕1 000）為一抗，山羊抗鼠（1﹕5 000）為二抗，進行Western Blot鑒定。

2 結果

2.1 酵母hem1敲除組件的構建

以BY4741基因組為模板，用設計的引物分別進行上下游同源臂序列的擴增，PCR結果可見約1 kb的條帶（圖2）。以質粒pYES2-CT為模板，用設計的引物進行篩選基因URA3的擴增，PCR結果可見約1 kb的條帶（圖2）。通過兩次重疊PCR技術依次將測序正確的上游同源臂、URA3、下游同源臂序列串聯成基因敲除組件，PCR結果可見約3 kb的條帶（圖2），回收目的片段，連接至 pMD19-T 載體，轉化TOP10 感受態細胞，陽性菌落送測序。以測序正確的pMD19-T-基因組敲除組件質粒為模板，用高保真KOD-FX酶進行PCR擴增，將PCR產物進行醇沉，獲得高濃度的敲除組件片段。

M1：DL250 DNA marker; M2：DL10000 DNA marker; 1-3：依次為上游同源臂、URA3、下游同源臂的PCR產物；4：敲除組件的兩次重疊PCR的終產物

2.2 酵母hem1敲除株的篩選與鑒定

采用醋酸鋰轉化法將敲除組件轉化至釀酒酵母BY4741中，其兩端與酵母基因組同源的序列進行同源重組，最終以loxP-URA3-loxP取代基因組中的，使得轉化子能在SD/-URA平板上（含250 μmol·L-1ALA）存活，轉化結果見圖3。為避免假陽性，對轉化子進行進一步驗證。

圖3 Δhem1敲除株的篩選

提取轉化子的基因組，用引物A-B、C-D、A-E、F-B、G-H、A-I、J-B進行PCR驗證。正確重組了敲除組件的轉化子用C-D、A-E、F-B 3對引物擴增沒有條帶，而用G-H、A-I、J-B 3對引物擴增目的帶大小分別為1 357、1 251和1 088 bp, 用引物A-B擴增目的帶為3 495 bp。以野生株BY4741基因組為對照用引物C-D、A-E、F-B 3對引物擴增目的帶大小分別為1 358、1 246和1 647 bp，而用G-H、A-I、J-B 3對引物擴增沒有條帶，用引物A-B擴增目的帶為4 054 bp。PCR擴增結果見圖4，測序結果與預期一致，說明成功獲得了基因敲除株。

M1：DL10000 DNA marker; M2：DL250 DNA marker; 1-7：依次為以A-B、C-D、A-E、F-B、G-H、A-I、J-B為引物時的PCR擴增產物

2.3 Δhem1表達載體構建與異源表達株的表型分析

已有研究表明，秀麗隱桿線蟲基因參與線蟲腸道血紅素的攝取，在低血紅素濃度下（＜1 μmol·L-1）可以拯救酵母缺失株的生長[23-24]，因此本研究將作為酵母斑點生長試驗的陽性對照組。將成功連接到pESC-LEU的的陽性質粒及空載轉化到敲除株中，挑選單克隆直接進行PCR鑒定，結果表明（圖5），目的條帶符合預期大小，5種表達載體已成功轉化到敲除株內。

為排除載體對酵母缺失株的影響，對轉化成功的異源表達株進行表型驗證，結果表明（圖6），和添加250 μmol·L-1ALA的培養基相比，在不添加ALA的培養基中，敲除株以及異源表達株的生長受到明顯抑制，證明確實是血紅素合成缺陷株且單純轉化5種表達載體對缺失株的表型沒有拯救作用。

2.4 目的蛋白的鑒定與斑點生長試驗

預測各蛋白大小，Hc-HRG-2約為33.6 kD，Ce-HRG-4約為20.3 kD，Hc-HRG-2 (ΔGST-N) 約為25 kD，Hc-HRG-2 (ΔGST-C) 約為25.7 kD，利用Western Blot對含有陽性表達質粒敲除株的目的蛋白進行鑒定。結果表明（圖7），除了空載組沒有目的帶，其余4種目的片段都在酵母中得到了表達，蛋白大小與預期一致。

將剩余菌液5倍比稀釋后點至含有250 μmol·L-1ALA或者不同濃度血紅素的平板上，生長情況見圖8。在0.04 μmol·L-1血紅素濃度下，與空載組相比，表達Hc-HRG-2的酵母生長提高了5倍，表達Ce-HGR-4的酵母生長提高了25倍，表達功能域缺失蛋白的酵母的生長沒有明顯提高。在0.1 μmol·L-1血紅素濃度下，與空載組相比，表達Hc-HRG-2的酵母的生長提高了25倍，表達Ce-HGR-4的酵母生長提高了625倍；表達Hc-HRG-2 (ΔGST-N) 的酵母生長提高了25倍，但是生長狀況與Hc-HRG-2組相比稍差一些；表達Hc-HRG-2 (ΔGST-C) 的酵母生長僅提高了5倍。隨著血紅素濃度的增加，試驗組和空載組之間的酵母生長差異會逐漸減少。上述結果表明，表達能夠在低血紅素濃度下（≤1 μmol·L-1）促進酵母對血紅素的攝取，拯救敲除株的生長缺陷；的硫氧還蛋白樣結構域（GST-N）和谷胱甘肽S-轉移酶C末端結構域（GST-C）在敲除株的表型拯救中發揮重要作用, 谷胱甘肽S-轉移酶C末端結構域相對更重要一些。

M: DL250 DNA marker; 1: pESC-LEU-Ce-hrg-4; 2: pESC-LEU-Hc-hrg-2; 3: pESC-LEU-Hc-hrg-2(Δgst-n); 4: pESC-LEU-Hc-hrg-2 (Δgst-c); 5: pESC-LEU

圖6 Δhem1敲除株及其異源表達株的表型驗證

3 討論

捻轉血矛線蟲是一種以吸食宿主血液為生的寄生性線蟲，探明其對血液中血紅素的利用及調控機制可以為藥靶的篩找以及疫苗的開發提供新的思路。由于捻轉血矛線蟲寄生階段的離體培養比較復雜[25]，借助結構相對簡單且研究技術成熟的真核模式生物進行功能研究成為了普遍的技術手段[26-28]。

M：蛋白marker; *表示目的條帶

釀酒酵母編碼5-氨基乙酰丙酸合成酶是血紅素合成途徑中的第一個酶，在血紅素合成過程中發揮著重要作用[29]。因此缺失菌株需要在生長培養基中添加5-氨基乙酰丙酸或者血紅素（≥10 μmol·L-1）才能生長[30]。根據上述特性，已有團隊成功在血紅素缺陷型釀酒酵母中對血液寄生原蟲以及秀麗隱桿線蟲等進行了建模，對血紅素應答相關基因進行了功能驗證[18, 20-21]，但是對捻轉血矛線蟲的建模尚未見報道。以釀酒酵母中缺失的同源物為前提，本研究首次成功在血紅素缺陷型釀酒酵母中對捻轉血矛線蟲進行建模，并初步探究了捻轉血矛線蟲血紅素轉運相關基因的功能。

前期試驗表明，是血紅素應答基因，高濃度血紅素的刺激可導致該基因的轉錄水平上調，其蛋白能夠在體外和血紅素結合并抑制蛋白的GST酶活性[17]。為了進一步驗證是否參與血紅素的轉運，本試驗在真核模式生物釀酒酵母中進行了相關功能的驗證。以BY4741為模板，通過同源重組技術成功獲得敲除株。與野生株BY4741相比，只有在培養基中添加5-氨基乙酰丙酸時才能生長，說明該敲除株的血紅素合成通路的確存在缺陷，可以用于建模。利用無縫克隆技術成功構建及其功能域缺失序列的酵母表達載體，對轉化成功的異源表達株進行表型驗證，結果表明，和添加250 μmol·L-1ALA的培養基相比，在不添加ALA的培養基中，敲除株以及異源表達株的生長受到明顯抑制。理論上，敲除株以及異源表達株在不添加ALA的培養基中不能生長，由于在本試驗中酵母是從含有ALA的培養基中直接挑選單克隆至不添加ALA的液體培養基中培養，酵母內源ALA可以維持酵母進行有限的擴增，所以結果中可以看到不添加ALA的培養基組酵母存在一定程度的生長。Western Blot鑒定結果表明C端標記有FLAG表位的Hc-HRG-2系列蛋白能夠在酵母敲除株內被半乳糖誘導表達，且其分子量的大小與預測一致。在酵母斑點生長試驗中，在≤0.1μmol·L-1血紅素濃度下表達Ce-HRG-4對酵母生長有顯著的促進作用，與前人的研究結果相一致[23]，說明本試驗條件下完全能夠實現在血紅素缺陷型釀酒酵母中對秀麗隱桿線蟲的建模。以此為前提，在≤1μmol·L-1血紅素濃度下表達Hc-HRG-2對酵母的生長有一定的促進作用，表明確實能拯救敲除株的生長缺陷，促進酵母細胞攝入外源血紅素，利用血紅素缺陷型釀酒酵母對捻轉血矛線蟲的建模確實可行。研究中還發現的兩個關鍵功能域硫氧還蛋白樣結構域和谷胱甘肽S-轉移酶C末端結構域在敲除株的表型拯救中都發揮重要作用, 且在≤1μmol·L-1血紅素濃度下可以觀察到谷胱甘肽S-轉移酶C末端結構域的缺失會導致拯救程度降低，表明該功能域相對更關鍵。值得注意的是，在低血紅素濃度下對敲除株的拯救程度明顯弱于，該結果與CHEN等在敲除株中對秀麗隱桿線蟲Ce-HRG-2進行建模時的結果類似[31]，表明促進細胞對血紅素的攝取可能不是的主要功能。參考Ce-HRG-2能夠介導參與隔離和再分配胞內血紅素的功能[31]，作為同源物的在血紅素調控中扮演的角色還需要進一步探究。

圖8 Δhem1敲除株及其各異源表達株在不同血紅素濃度的平板上的生長情況

4 結論

本試驗首次成功在血紅素缺陷型釀酒酵母中對捻轉血矛線蟲進行建模，證明了血紅素應答基因能促進細胞對血紅素的利用，并且其兩個谷胱甘肽S-轉移酶相關功能域發揮重要作用。

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ofRescues the Growth of Heme Deficient Yeast Strain

ZHOU JingRu, WU Fei, CHEN XueQiu, HUANG Yan, SHI HengZhi, DU AiFang, YANG Yi

College of Animal Science, Zhejiang University/Key Laboratory of Animal Preventive Medicine of Zhejiang Province, Hangzhou 310058

【】In previous study, we have identified a heme responsive gene(), with a high transcriptional level in the presence of high concentration of heme. However its function in heme regulation is still lacking research. To verify thatwas involved in the intracellular heme transport, agene knockout strain of, which was heme deficient, was constructed by homologous recombination technique and then exogenously expressedofto rescue the growth of the knockout strain. 【】The genomic DNA ofBY4741 was used as a template to obtain the upstream and downstream homology sequences of(SGD: S000002640) gene. The plasmid pYES2-CT was used to obtain the screening marker URA3 sequence. Two overlapping PCR techniques were used to sequentially connect upstream homology sequence, URA3, and downstream homology sequence to form the knockout components which was purified and then transformed into BY4741 competent cells by lithium acetate transformation method, and the transformants were selected on SD /-URA plates supplemented with 250 μmol·L-15-aminolevulinic acid (ALA). PCR identification using multiple primer pairs was further performed to verify the correctness ofstrain. Thesequence (GenBank: MK371241) of Zhejiang strain and its functional domain deleted sequenceandwere amplified from the plasmids and inserted into the yeast expression vector pESC-LEU through a seamless cloning kit. The expression vectors, which were identified and sequenced to be correct, were then transformed intocompetent cells and selected on SD/-URA/-LEU (containing 250 μmol·L-1ALA) plates. PCR identification was performed to verify the positive exogenous expression strain. By comparing the growth ofstrain and its exogenous expression strains in SD/-URA/-LEU liquid medium with or without 250 μmol·L-1ALA, the phenotype of the knockout strain were further verifiedand the effects of expression vectors on phenotype were excluded. The exogenous expression strains were induced by 2% w/v galactose and then sonicated to identify the protein expression by Western Blot. The induced strains were resuspended to an OD600of 0.2 and 4 μL of 5-fold serial dilutions of each induced strain was spotted onto 2% w/v galactose plates supplemented with either 250 μmol·L-1ALA or different concentrations of heme for 2 to 3 days at 28 ℃to compare the growth of the strains.【】Thegene knockout strain was successfully obtained. Compared with wild strain,cannot synthesis hemeand requires ALA (250 μmol·L-1) or heme (≥10 μmol·L-1) for growth. The phenotypes of the exogenous expression strains were consistent with that of the knockout strain. Western Blot results indicated that 2% w/v galactose could successfully induce the expression ofand its functional domain deleted gene in the knockout strain.expression allowedto import heme from the environment, and rescued the growth ofstrainNotably, the deletion of two signature domains of, a thioredoxinlike (GST-N) and a glutathione S-transferase C-terminal domain-like (GST-C), could reduce the effect of rescue. 【】could facilitate heme uptake in cellsand its functional domains, GST-N and GST-C, played an important role in this process. This study laid a solid foundation for further exploring heme transport mechanism of

; heme;;;strain; exogenously expression; rescue

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.08.018

2020-05-06；

2020-10-15

國家自然科學基金（31602041）、國家重點研發計劃（2017YFD0501200）、浙江省基礎公益研究計劃（LGN20C180005）

周靜茹，Tel：18868105390；E-mail：1134684756@qq.com。通信作者杜愛芳，E-mail：afdu@zju.edu.cn。通信作者楊怡，E-mail：yangyi0607 @zju.edu.cn

（責任編輯 林鑒非）