模擬酸雨對(duì)番茄光合作用和病害發(fā)生的影響及油菜素內(nèi)酯對(duì)其緩解效應(yīng)

李建鑫，王文平，胡璋健，師愷

模擬酸雨對(duì)番茄光合作用和病害發(fā)生的影響及油菜素內(nèi)酯對(duì)其緩解效應(yīng)

李建鑫，王文平，胡璋健，師愷

浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州 310058

【】在全球氣候變化大背景下，酸雨沉降日益加劇，嚴(yán)重影響蔬菜等農(nóng)作物的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性。油菜素內(nèi)酯（brassinosteroid，BR）是一類植物體中廣泛存在的植物激素，具有廣譜調(diào)控植物抗性的作用。研究外源油菜素內(nèi)酯對(duì)模擬酸雨環(huán)境下蔬菜作物光合作用和病害發(fā)生的影響，明確其對(duì)酸雨條件下蔬菜危害的緩解效應(yīng)，對(duì)蔬菜作物安全生產(chǎn)提供指導(dǎo)。本研究以番茄（L.）‘合作903’為材料，在模擬酸雨（模擬酸雨1（simulated acid rain 1，SiAR1）：NH4NO3（1.3 g·L-1）、MgSO4·7H2O（3.1 g·L-1）、Na2SO4（2.5 g·L-1）、KHCO3（1.3 g·L-1）、CaCl2·2H2O（3.1 g·L-1），用1 N H2SO4調(diào)節(jié)pH至3.0；模擬酸雨2（SiAR2）：杭州地區(qū)春季收集的雨水，pH調(diào)至3.0）和對(duì)照（噴施dH2O）條件下研究酸雨對(duì)番茄葉片光合作用和pv.DC3000（DC3000）引發(fā)的細(xì)菌性葉斑病發(fā)生的影響，其次在模擬酸雨和對(duì)照條件下對(duì)番茄葉片外源施用BR，研究外源施用BR對(duì)番茄葉片的光合特性和細(xì)菌性葉斑病發(fā)生的緩解作用，為了研究BR緩解作用的內(nèi)在機(jī)制，測(cè)定番茄葉片光合作用關(guān)鍵基因、、和抗病基因、的表達(dá)以及抗氧化酶的活性。模擬酸雨導(dǎo)致番茄葉片凈光合作用速率（Pn）、光系統(tǒng)II實(shí)際光化學(xué)效率（ΦPSII）及光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）顯著下降；模擬酸雨削弱了番茄對(duì)DC3000的抗性，導(dǎo)致細(xì)菌性葉斑病發(fā)病率上升和菌落數(shù)顯著增加。外源施用BR提高酸雨和對(duì)照條件下番茄葉片的光合作用，并有效增強(qiáng)了酸雨條件下番茄對(duì)DC3000的抗性，使酸雨條件下葉片菌落數(shù)下降，光系統(tǒng)II實(shí)際光化學(xué)效率提高。探究BR緩解效應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制發(fā)現(xiàn)，外源施用BR顯著提高了番茄葉片光合作用關(guān)鍵基因、、和抗病基因、等的表達(dá)，降低了膜脂質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA）的含量，并增加了愈創(chuàng)木酚過氧化物酶（G-POD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶的活性，從而緩解模擬酸雨對(duì)番茄光合和抗病性的抑制作用。外源施用BR能夠顯著提高番茄內(nèi)源光合相關(guān)基因和抗病基因的表達(dá)及抗氧化酶的活性，有效促進(jìn)酸雨環(huán)境中番茄等園藝作物的生長(zhǎng)和增強(qiáng)抗病性。

番茄；酸雨；油菜素內(nèi)酯；光合作用；細(xì)菌性葉斑病

0 引言

【研究意義】酸雨（Acid rain）是指pH小于5.6的各種形式大氣降水[1]。在全球氣候變化大背景下，近年來(lái)我國(guó)酸雨頻現(xiàn)，嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育及其健康生產(chǎn)[2-3]。但是，酸雨對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)和抗性的影響，尤其是對(duì)蔬菜作物光合作用和病害發(fā)生的影響機(jī)理研究甚少，更缺乏針對(duì)酸雨危害的有效緩解途徑。油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroid，BR）是甾醇類植物激素，具有高效調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育的生理效應(yīng)，并且能夠提高植物對(duì)多種逆境的抗性[4-5]，但BR對(duì)酸雨脅迫下植物光合及抗病性是否具有調(diào)控作用尚未見報(bào)道。番茄作為一種重要蔬菜栽培種類和研究模式作物，以其為研究對(duì)象，探究外源BR對(duì)酸雨脅迫下番茄光合作用和病害發(fā)生的調(diào)控作用，對(duì)蔬菜作物的高產(chǎn)高效安全生產(chǎn)具有一定的理論和現(xiàn)實(shí)意義。【前人研究進(jìn)展】番茄是我國(guó)種植面積最大的蔬菜作物之一，南方以露地栽培為主，北方以保護(hù)地栽培為主。近年來(lái)，我國(guó)番茄年播種面積已達(dá)兩千萬(wàn)畝，露地播種面積約九百萬(wàn)畝，占總播種面積的45%。2018年，我國(guó)受酸雨影響的面積達(dá)到53萬(wàn)km2，酸雨造成的蔬菜減產(chǎn)損失超22億元，其中酸雨污染主要分布在長(zhǎng)江以南—云貴高原以東地區(qū)[6]。酸雨影響植物的種子萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育和抗性形成等一系列生命進(jìn)程。其中，酸雨對(duì)植物生長(zhǎng)的最大影響體現(xiàn)在其能破壞植株光合作用[7-8]。有研究表明，長(zhǎng)時(shí)間酸雨環(huán)境會(huì)導(dǎo)致番茄類囊體膜的扭曲，破壞植物葉綠體結(jié)構(gòu)[9-10]。用不同酸度的酸雨噴淋油菜發(fā)現(xiàn)，隨著酸雨強(qiáng)度增加，油菜的光合作用被嚴(yán)重抑制[11]。另一方面，酸雨對(duì)植物的影響還體現(xiàn)在其對(duì)植物抗病性的抑制上。有關(guān)研究表明，酸雨能通過影響水楊酸（salicylic acid，SA）信號(hào)路徑調(diào)控辣椒與細(xì)菌性葉斑病病菌（）的相互作用[12]。酸雨還能破壞小麥植株的角質(zhì)層，導(dǎo)致小麥對(duì)條銹病（f. sp.）抗性的減弱[13]。然而，酸雨會(huì)抑制香蕉葉斑病致病菌殼針孢菌（）孢子的萌發(fā)和繁殖，使酸雨區(qū)香蕉葉斑病發(fā)病率比非酸雨區(qū)發(fā)病率明顯降低[14]。但酸雨對(duì)植物與病原菌互作的影響尚未確定，有待深入研究。為了減少環(huán)境污染對(duì)農(nóng)作物造成的危害，目前越來(lái)越多的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑被應(yīng)用于促進(jìn)生產(chǎn)，減少病害[15-16]。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)BR不僅能夠提高植物的光合作用，調(diào)控光形態(tài)建成[17]，還具有廣譜抗性，能夠顯著提高植物對(duì)多種病原菌的抗性，包括丁香假單胞菌（）、白粉病菌（sp.）、稻瘟病菌（）、水稻黃單胞菌（）[18]。但是BR是否能夠有效緩解酸雨對(duì)植物生長(zhǎng)和抗病等進(jìn)程帶來(lái)的不良影響尚且未知。【本研究切入點(diǎn)】酸雨對(duì)作物造成了嚴(yán)重的危害，導(dǎo)致光合作用的抑制和抗病性降低。作為植物內(nèi)源激素，BR在植物諸多逆境響應(yīng)中發(fā)揮了重要的積極作用。因此，探究外源施用BR是否能夠緩解模擬酸雨下光合作用的下降以及病害加重的效應(yīng)，并解析其內(nèi)在機(jī)制非常必要。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過對(duì)植物光合作用和抗病響應(yīng)相關(guān)參數(shù)的分析，評(píng)估模擬酸雨對(duì)番茄光合和病害抗性造成的影響，及BR對(duì)酸雨脅迫的緩解作用。進(jìn)一步利用qRT-PCR技術(shù)分析外源施用BR對(duì)模擬酸雨下番茄內(nèi)源光合和抗病相關(guān)基因表達(dá)的變化，并分析抗氧化酶活性的變化，深入挖掘BR緩解酸雨脅迫的內(nèi)在機(jī)制，為緩解酸雨對(duì)蔬菜等園藝作物危害和園藝作物高產(chǎn)高效安全生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016—2019年在浙江大學(xué)蔬菜研究所溫室及實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試番茄（L.）‘合作903’品種。番茄種子于55℃浸種10 min后置于28℃催芽2 d，待種子發(fā)芽后播種于含有草炭與蛭石為2﹕1（v/v）的50孔穴盤中，播種7 d后，將兩片真葉充分展開的番茄幼苗移至營(yíng)養(yǎng)缽（外徑10 cm，高8.5 cm）中繼續(xù)生長(zhǎng)，控制生長(zhǎng)環(huán)境條件為：溫度25℃/21℃（晝/夜），光周期為12 h /12 h（晝/夜），光照強(qiáng)度為200 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度60%左右。待番茄長(zhǎng)至4葉1心時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。模擬酸雨處理：選取生長(zhǎng)狀況一致的番茄植株分別噴施：模擬酸雨1（simulated acid rain 1，SiAR1），參照Velikova等[19]酸雨的配方：NH4NO3（1.3 g·L-1）、MgSO4·7H2O（3.1 g·L-1）、Na2SO4（2.5 g·L-1）、KHCO3（1.3 g·L-1）、CaCl2·2H2O（3.1 g·L-1），用1 N H2SO4調(diào)節(jié)pH至3.0；模擬酸雨2（SiAR2），為杭州地區(qū)春季收集的雨水，pH調(diào)至3.0）；噴施dH2O作為對(duì)照。每次均勻噴施番茄葉面，以噴滿整個(gè)葉面而沒有水滴落下為準(zhǔn)。每天處理一次，連續(xù)處理4 d。外源BR處理：噴施模擬酸雨前24 h，用1 μmol?L-1BR噴施番茄植株葉片，以ddH2O作為對(duì)照。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 光合作用參數(shù)測(cè)定 用LI-6400型光合熒光測(cè)量系統(tǒng)（美國(guó)LI-COR公司）測(cè)定番茄凈光合作用速率（Pn）、光化學(xué)淬滅（qP）。測(cè)定條件：光強(qiáng)為800 μmol?m-2?s-1，CO2濃度為400 μL·L-1，葉面溫度為（25±1.5）℃。葉綠素?zé)晒馐褂肐maging-PAM調(diào)制熒光成像系統(tǒng)（IMAG-MAXI；Heinz Walz，Germany）進(jìn)行測(cè)定。植株暗適應(yīng)0.5 h后，光化光強(qiáng)度和飽和光強(qiáng)度分別設(shè)為280 μmol?m-2?s-1和4 000 μmol?m-2?s-1，光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H光化學(xué)效率計(jì)算公式為ΦPSII=（Fm′-F）/Fm′[20]，其中，F(xiàn)為任意時(shí)間實(shí)際熒光產(chǎn)量，F(xiàn)m′為最大熒光產(chǎn)量。

1.2.2 病原菌的培養(yǎng)與接種 丁香假單胞菌番茄變種（pv.DC3000，DC3000）的培養(yǎng)參照THILMONY等[21]的方法，將DC3000菌種在含有25 mg·L-1利福平的KB固體培養(yǎng)基上于28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。挑取單菌落于同樣濃度抗生素的KB液體培養(yǎng)基中于28℃、200 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)約8—12 h后，調(diào)濃度至OD600=0.8—1.0，4 000×、4℃下離心5 min，得到的沉淀即為菌體。將菌體用10 mmol?L-1MgCl2清洗兩次后重新懸浮，濃度調(diào)為OD600= 0.01，加入有機(jī)硅至終濃度為0.03%。接病處理為將病原菌溶液均勻噴施番茄葉面，對(duì)照處理則噴施含有終濃度為0.03%有機(jī)硅的10 mmol?L-1MgCl2溶液。

1.2.3 番茄植株感病評(píng)估DC3000細(xì)菌數(shù)量的計(jì)算參照KOCH等[22]的方法，取直徑1.0 cm接種過病菌的番茄葉圓片，每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6個(gè)葉圓片。將葉圓片在70%的酒精中浸泡10 s后，用dH2O沖洗，置于含有500 μLMgCl2（10 mmol?L-1）的1.5 mL磨樣管中，4 000 r/min，20 s充分研磨。吸取磨好的樣品用10 mmol?L-1的MgCl2進(jìn)行梯度稀釋。取每個(gè)稀釋液10 μL點(diǎn)在含有25 mg·L-1利福平的KB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2 d，取菌落數(shù)范圍在“9—90”的點(diǎn)計(jì)算葉片菌落數(shù)（Colony-forming unit，CFU）的數(shù)量。臺(tái)盼藍(lán)染色參照LEGRAND等[23]的方法并有所改進(jìn)。將番茄葉圓片浸入65℃預(yù)熱的染色液中，煮沸10 min后用保鮮膜包嚴(yán)，搖床上染色5—6 h。染色后將葉圓片置于脫色液中，脫色3—4次，每次洗滌5—6 h至葉片透明。透明葉片分別置于LEICA- DM400B顯微鏡下拍照。

1.2.4 抗氧化物酶活性及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量測(cè)定 取0.3 g植物樣品，加入3 mL 50 mmol?L-1的PBS緩沖液，冰浴中研磨成勻漿，4℃下12 000 r/min離心20 min，取上清液用于抗氧化物酶活性測(cè)定。抗氧化酶活性及丙二醛含量測(cè)定參考陳建勛等[24]的方法。過氧化物酶（Guaiacol peroxidase，G- POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性采用紫外吸收法，蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照BRADFORD[25]的考馬斯亮藍(lán)法，MDA含量采用硫代巴比妥酸（Thiobarbituric acid，TBA）法測(cè)定[26]。

1.2.5 植物總RNA提取和qRT-PCR檢測(cè) 植物總RNA的提取參照天根生化公司（TIANGEN）試劑盒操作步驟；cDNA的合成參照TOYOBO公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟。

qRT-PCR在熒光定量PCR Light Cycler 480Ⅱ平臺(tái)（Roche）上進(jìn)行，反應(yīng)條件參見AceQ qPCR SYBR Green Master Mix熒光染料試劑盒（Vazyme公司），qRT-PCR引物的設(shè)計(jì)采用軟件Primer 5.0，特異性引物序列如表1所示。

PCR反應(yīng)體系設(shè)置為：10 μL AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，1 μL cDNA模板，上、下游引物各0.4 μL，7.2 μL ddH2O。選取番茄的看家基因作為熒光定量的內(nèi)參指標(biāo)，相對(duì)基因表達(dá)量參照LIVAK等[27]的2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)結(jié)果均為3次重復(fù)的平均值，利用Microsoft Excel 2016整理數(shù)據(jù)；運(yùn)用SAS 9.1 Tukey法進(jìn)行差異顯著性分析；運(yùn)用Origin 2017作圖。

表1 基因qRT-PCR特異性引物

2 結(jié)果

2.1 模擬酸雨對(duì)番茄葉片光合作用和抗病性的影響

SiAR1和SiAR2處理的番茄植株相較于對(duì)照植株，其葉片的Pn分別下降了16.5%與18.4%（圖1-A），ΦPSII分別降低15.5%與12.8%（圖1-B），而qP也分別下降了13.4%與10.3%（圖1-C）。上述結(jié)果表明模擬酸雨處理導(dǎo)致番茄光合反應(yīng)速率減弱，光能利用率降低，導(dǎo)致光合作用受到抑制。

利用模擬酸雨體外培養(yǎng)DC3000病原菌，發(fā)現(xiàn)酸雨條件下病原菌12 h時(shí)生長(zhǎng)量?jī)H為對(duì)照的6.8%（圖2-A），表明模擬酸雨能顯著抑制病原菌DC3000增殖。但是，對(duì)模擬酸雨處理過的番茄植株接種DC3000病原菌，接種2 d后觀察發(fā)現(xiàn)SiAR1和SiAR2處理的番茄植株葉片發(fā)病比對(duì)照組更嚴(yán)重（圖2-B）。此外，模擬酸雨加劇了DC3000侵染后番茄葉片中死細(xì)胞的積累，使番茄植株發(fā)病率提高了2倍（圖2-C），同時(shí)也導(dǎo)致番茄葉片上的病原菌菌落數(shù)增加了約38.4%（圖2-D）。綜上，模擬酸雨處理削弱了番茄對(duì)DC3000的抗性。

2.2 BR對(duì)模擬酸雨環(huán)境下番茄光合作用的影響

在SiAR1和SiAR2兩種模擬酸雨環(huán)境下，外源施用1 μmol?L-1BR后，番茄植株的Pn比對(duì)照分別提高了13.7％和14.8%（圖3-A），ΦPSII分別提高了7.8%和11.1%（圖3-B），qP分別提高了12.8%和18.1%（圖3-C）。綜上，外源施用BR顯著提高了模擬酸雨環(huán)境下番茄的光合效率。

2.3 BR對(duì)模擬酸雨環(huán)境下番茄細(xì)菌性葉斑病抗性的影響

在非酸雨處理環(huán)境下，外源BR處理組細(xì)菌菌落數(shù)與對(duì)照組相比降低了3.8%；這一效應(yīng)在模擬酸雨環(huán)境下更加明顯，對(duì)番茄葉片進(jìn)行SiAR1、SiAR2處理后外源施用BR，其細(xì)菌菌落數(shù)與對(duì)照相比都降低了約7.7%（圖4-A）。從圖4-B可以看出，接種DC3000并酸雨處理的葉片ΦPSII值均降低，而在酸雨條件下外源施用BR后能明顯緩解因病原菌接種導(dǎo)致的ΦPSII下降，這與細(xì)菌菌落數(shù)ΦPSII成像圖（圖4-C）的結(jié)果表現(xiàn)一致。因此，外源施用BR使番茄葉片DC3000菌落生長(zhǎng)量降低，在一定程度上抑制了菌落的生長(zhǎng)，并使病菌對(duì)ΦPSII的影響減小，能夠顯著緩解細(xì)菌性葉斑病造成的ΦPSII降低，尤其能夠緩解酸雨環(huán)境下病菌對(duì)番茄的危害。

2.4 BR對(duì)模擬酸雨和Pst DC3000處理?xiàng)l件下光合作用和抗病相關(guān)基因表達(dá)的影響

進(jìn)一步測(cè)定光合作用關(guān)鍵酶果糖-1,6-二磷酸酶（FBPase）、景天庚酮糖-1,7-二磷酸酯酶（SBPase）、核酮糖1,5-二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）等編碼基因的表達(dá)量情況。模擬酸雨處理4 d后，等基因表達(dá)均受到了不同程度的抑制（圖5），外源施用BR后，酸雨條件下的表達(dá)量相對(duì)于未進(jìn)行BR處理的對(duì)照增加了3—7倍（圖5）。表明酸雨抑制了光合作用相關(guān)基因的表達(dá)，而酸雨環(huán)境下外源BR有助于激活光合作用相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)番茄的光合作用。同樣，外源施用BR后，番茄在模擬酸雨條件下響應(yīng)病原菌入侵時(shí)病程相關(guān)基因比對(duì)照上調(diào)了6—8倍（圖6-A），則上調(diào)了4—13倍（圖6-B），BR誘導(dǎo)的內(nèi)源抗病基因表達(dá)上調(diào)有助于提高番茄對(duì)DC3000的抗性。

H2O：對(duì)照組，用dH2O噴施葉片；SiAR1：SiAR1噴施葉片；SiAR2：SiAR2噴施葉片。不同小寫字母表示處理間差異顯著（P＜0.05）。下同

圖2 模擬酸雨對(duì)番茄對(duì)細(xì)菌性葉斑病發(fā)生的影響

圖3 外源BR對(duì)模擬酸雨環(huán)境下番茄光合系統(tǒng)的影響

圖4 外源BR對(duì)模擬酸雨環(huán)境下番茄細(xì)菌性葉斑病抗性的影響

此外，外源施用BR使兩種模擬酸雨環(huán)境下MDA含量分別降低了22.8%和21.9%（圖7-A），使G-POD活性分別提高了19.6%和22.8%（圖7-B），CAT的活性分別提高29.1%和21.6%（圖7-C）。以上結(jié)果表明，酸雨與BR都能夠影響番茄的氧化還原穩(wěn)態(tài)，外源施用BR能夠顯著降低番茄的膜脂過氧化水平，并在酸雨處理的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高抗氧化酶的活性，進(jìn)而提高番茄植株對(duì)酸雨的抗性。

圖5 外源BR對(duì)在模擬酸雨下番茄葉片中光合相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖6 外源BR對(duì)在模擬酸雨下番茄葉片中抗病基因表達(dá)的影響

圖7 外源BR對(duì)番茄葉片中MDA含量和抗氧化酶活性的影響

3 討論

葉片是植物光合作用的主要器官，酸雨會(huì)直接影響葉片的生理狀況和光合機(jī)構(gòu)進(jìn)而影響葉片的光合作用。前人研究表明，酸雨可以影響植物的葉綠素?zé)晒鈪?shù)、氣孔運(yùn)動(dòng)、光合色素、光合蛋白酶等來(lái)危害植物的光合作用，使植物光合作用速率降低[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，模擬酸雨處理4 d使番茄葉片的Pn顯著降低，這與姚桃峰等[29]研究酸雨使拔節(jié)期小麥Pn顯著下降的結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)，酸雨對(duì)不同生態(tài)型和不同生育期植物的Pn均有顯著影響[30]。酸雨不僅降低番茄的光合速率，還破壞番茄的光化學(xué)系統(tǒng)。本研究中酸雨使番茄PSII嚴(yán)重受損，類似研究也有報(bào)道，YU等[31]研究黃瓜發(fā)現(xiàn)經(jīng)酸雨處理3 h后，ΦPSII隨酸雨的pH減小呈顯著下降趨勢(shì)。GABARA等[32]用pH 1.8的酸雨噴淋番茄，發(fā)現(xiàn)其PSII結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲，酸雨還能導(dǎo)致活性氧積累來(lái)加重PSII的損傷[33]。

酸雨對(duì)植物-病原菌互作的影響是復(fù)雜的，其引起的酸性環(huán)境能夠顯著抑制病菌的萌發(fā)和繁殖能力，本研究用酸雨體外培養(yǎng)病菌發(fā)現(xiàn)酸雨顯著抑制了DC3000病菌繁殖。有研究報(bào)道，酸雨處理使小麥葉枯病菌（）孢子萌發(fā)率顯著降低，而且雨水中亞硫酸鹽濃度的升高顯著增加了小麥穎枯病菌（）的感染率[34]。酸雨還可能通過降低寄主植物免疫能力，增強(qiáng)病原菌致病力來(lái)削弱植物的抗病性。本研究中模擬酸雨處理后番茄侵染DC3000，發(fā)現(xiàn)番茄感病更加嚴(yán)重，抗病性明顯下降。袁志文[35]研究發(fā)現(xiàn)，在鄰近重酸雨區(qū)的馬尾松落針病（）和赤落葉病（）的病情較無(wú)酸雨區(qū)更加嚴(yán)重，酸性降水增加了對(duì)表皮的侵蝕，植物的免疫系統(tǒng)受到損害，病菌擴(kuò)散更為迅速，導(dǎo)致死細(xì)胞數(shù)量明顯增多。上述研究結(jié)果說明酸雨影響植物光合作用的同時(shí)，加劇了細(xì)菌性葉斑病的發(fā)生。

BR作為植物體內(nèi)重要的激素，能夠調(diào)節(jié)植物葉片的發(fā)育，并參與光形態(tài)建成，直接和間接的調(diào)節(jié)植物的光合作用[36]。本試驗(yàn)中外源施用BR能顯著提高模擬酸雨環(huán)境下番茄葉片的Pn、qP和ΦPSII，增加酸雨脅迫下PSII反應(yīng)中心的光能利用率，有效緩解酸雨對(duì)光合作用的損害。JIN等[37]在高溫脅迫下對(duì)榕樹進(jìn)行BR處理，顯著提高了抗氧化酶活性并有效減輕高溫對(duì)PSII反應(yīng)中心的損傷。研究發(fā)現(xiàn)酸雨脅迫與其他逆境脅迫類似，都會(huì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過量活性氧，破壞光合結(jié)構(gòu)，而外源BR有助于緩解活性氧等有害物質(zhì)的積累。陸曉民[38]用1 mg·L-1BR處理大豆，提高了漬水脅迫下大豆幼苗的葉綠素含量、脯氨酸含量，并抑制了MDA增生，降低了細(xì)胞膜透性，提高了大豆的光合作用。同樣，KUREPIN等[39]的研究也證實(shí)外源BR有助于緩解弱光脅迫，提高植物的光合作用。另外有研究表明，F(xiàn)BPase、SBPase、Rubisco都是光合碳代謝和光呼吸的關(guān)鍵酶，可以直接影響碳固定[40]。本研究中酸雨抑制了、、的表達(dá)，而外源施用BR顯著提高了這些基因的表達(dá)。光照條件下，BR可以通過BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子BZR1（Brassinazole resistant 1）結(jié)合于光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子來(lái)調(diào)控光合基因的表達(dá)[41]。在模擬酸雨條件下，外源施用BR能夠誘導(dǎo)其信號(hào)元件參與到光信號(hào)途徑中，調(diào)控光合基因的表達(dá)，進(jìn)而提高植物的光合作用，增強(qiáng)PSII光化學(xué)反應(yīng)能力，保護(hù)植物的光合結(jié)構(gòu)[42]。

BR除了具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育等作用外，其信號(hào)途徑在植物免疫反應(yīng)中也發(fā)揮著積極的正調(diào)節(jié)作用[43]。BRI1（Brassinosteroid insensitive 1）是細(xì)胞膜表面受體，它能夠識(shí)別BR信號(hào)。有研究報(bào)道，煙草中BR參與到乙烯介導(dǎo)的對(duì)DC3000的抗性，外源BR與乙烯均能提高煙草的抗性，而且BRI1的缺失也導(dǎo)致煙草對(duì)DC3000更加敏感[44]。本試驗(yàn)對(duì)番茄葉片外源施用BR后，顯著抑制了病原菌在植物中的生長(zhǎng)。有研究報(bào)道外施BR可以增強(qiáng)煙草抵御和sp.侵染[43]；同樣噴施BR后，葡萄對(duì)霜霉病（）和灰霉病（）的抗性都顯著增強(qiáng)[45]。本研究中，外源施用BR顯著提高了番茄植株響應(yīng)DC3000時(shí)內(nèi)源抗病基因和的表達(dá)，這與擬南芥中BR信號(hào)能夠提高抗病基因表達(dá)，激活免疫反應(yīng)的模式類似[46]。另外，多種逆境脅迫都會(huì)導(dǎo)致植物積累活性氧等有害物質(zhì)，而植物通過提高抗氧化酶活性來(lái)緩解逆境脅迫，酸雨脅迫也不例外。本試驗(yàn)中不僅酸雨使抗氧化酶活性增加，外源施用BR也使酸雨條件下多種抗氧化酶活性提高，有助于激活番茄的抗性，使番茄更能抵御酸雨的侵害。

4 結(jié)論

模擬酸雨不僅導(dǎo)致番茄作物光合作用下降，還加劇了番茄細(xì)菌性葉斑病的發(fā)生。外源施用BR則能顯著促進(jìn)番茄內(nèi)源光合與抗病相關(guān)基因的表達(dá)，提高抗氧化酶活性，有效緩解模擬酸雨對(duì)光合作用的危害，同時(shí)提高對(duì)細(xì)菌性葉斑病的抗性。因此，外源施用BR有助于提高植物對(duì)酸雨脅迫的抗性，研究結(jié)果為應(yīng)對(duì)酸雨危害，探索酸雨脅迫緩解途徑提供了科學(xué)依據(jù)。

[1] EVANS L S. Botanical aspects of acidic precipitation. The Botanical Review, 1984, 50(4): 449-490.

[2] 劉萍, 夏菲, 潘家永, 陳益平, 彭花明, 陳少華. 中國(guó)酸雨概況及防治對(duì)策探討. 環(huán)境科學(xué)與管理, 2011, 36(12): 30-35, 84.

LIU P, XIA F, PAN J Y, CHEN Y P, PENG H M, CHEN S H. Discuss on present situation and countermeasures for acid rain prevention and control in China.Environmental Science and Management, 2011, 36(12): 30-35, 84. (in Chinese)

[3] 黎華壽, 聶呈榮, 胡永剛. 模擬酸雨對(duì)雜交稻常規(guī)稻野生稻影響的研究. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 23(2): 284-287.

LI H S, NIE C R, HU Y G. Effects of simulated acid rain on hybrid, common and wild rice varieties. Journal of Agro-Environment Science, 2004, 23(2): 284-287. (in Chinese)

[4] CAO Y Y, ZHAO H. Protective roles of brassinolide on rice seedlings under high temperature stress. Rice Science, 2008, 15(1): 63-68.

[5] SYMONS G M, DAVIES C, SHAVRUKOV Y, DRY I B, REID J B, THOMAS M R. Grapes on steroids brassinosteroids are involved in grape berry ripening. Plant Physiology, 2006, 140(1): 150-158.

[6] 2018年《中國(guó)生態(tài)環(huán)境狀況公報(bào)》(摘錄一). 環(huán)境保護(hù), 2019, 47(11): 47-53.

China ecological environment status bulletin in 2018 (Excerpt 1). Environmental Protection, 2019, 47(11): 47-53. (in Chinese)

[7] ZHANG J, JIANG X D, LI T L, CAO X J. Photosynthesis and ultrastructure of photosynthetic apparatus in tomato leaves under elevated temperature. Photosynthetica, 2014, 52(3): 430-436.

[8] WANG L H, WANG W, ZHOU Q, HUANG X H. Combined effects of lanthanum (III) chloride and acid rain on photosynthetic parameters in rice. Chemosphere, 2014, 112: 355-361.

[9] DEBNATH B, HUSSAIN M, IRSHAD M, MITRA S, LI M, LIU S, QIU D L. Exogenous melatonin mitigates acid rain stress to tomato plants through modulation of leaf ultrastructure, photosynthesis and antioxidant potential.Molecules, 2018, 23(2): 388-403.

[10] GABARA B, SK?ODOWSKA M, WYRWICKA A, GLI?SKA S, GAPI?SKA M. Changes in the ultrastructure of chloroplasts and mitochondria and antioxidant enzyme activity inMill. leaves sprayed with acid rain. Plant Science, 2003, 164(4): 507-516.

[11] 麥博儒, 鄭有飛, 吳榮軍, 梁駿, 劉霞. 模擬硫酸型、硝酸型及其混合型酸雨對(duì)油菜生理特性、生長(zhǎng)和產(chǎn)量的影響. 植物生態(tài)學(xué)報(bào), 2010, 34(4): 427-437.

MAI B R, ZHENG Y F, WU R J, LIANG J, LIU X. Effects of simulated sulfur-rich, nitric-rich and mixed acid rain on the physiology, growth and yield of rape (). Chinese Journal of Plant Ecology, 2010, 34(4): 427-437. (in Chinese)

[12] DUTTA B, LANGSTON D B, LUO X, CARLSON S, KICHLER J, GITAITIS R. A risk assessment model for bacterial leaf spot of pepper (), caused by, based on concentrations of macronutrients, micronutrients, and micronutrient ratios. Phytopathology, 2017, 107(11): 1331-1338.

[13] 王樹和, 孫佩璐, 周文楠, 劉婷, 馬占鴻. 模擬酸雨對(duì)小麥條銹病流行學(xué)組分的影響. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2018, 45(1): 173-180.

WANG S H, SUN P L, ZHOU W N, LIU T, MA Z H. Effect of simulated acid rain on disease progress of wheat yellow rust. Journal of Plant Protection, 2018, 45(1): 173-180. (in Chinese)

[14] TRUJILLO E E, KADOOKA C Y, TANIMOTO V, BERGFELD S, SHISHIDO G, KAWAKAMI G. Effective biomass reduction of the invasive weed species banana poka by septoria leaf spot. Plant Disease, 2001, 85(4): 357-361.

[15] VERMA V, RAVINDRAN P, KUMAR P P. Plant hormone-mediated regulation of stress responses. BMC Plant Biology, 2016, 16(1): 86.

[16] HAN S Y, LIU H, YAN M, QI F Y, WANG Y Q, SUN Z Q, HUANG B Y, DONG W Z, TANG F S, ZHANG X Y, HE G H. Differential gene expression in leaf tissues between mutant and wild-type genotypes response to late leaf spot in peanut (L.). PLoS ONE, 2017, 12(8): e0183428.

[17] AHAMMED G J, CHOUDHARY S P, CHEN S, XIA X, SHI K, ZHOU Y, YU J. Role of brassinosteroids in alleviation of phenanthrene- cadmium co-contamination-induced photosynthetic inhibition and oxidative stress in tomato. Journal of Experimental Botany, 2013, 64(1): 199-213.

[18] YU M H, ZHAO Z Z, HE J X. Brassinosteroid signaling in plant-microbe interactions. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(12): 4091.

[19] VELIKOVA V, YORDANOV I, KURTEVA M, TSONEV T. Effects of simulated acid rain on the photosynthetic characteristics ofL. Photosynthetica, 1998, 34(4): 523-535.

[20] SUN Y J, GENG Q W, DU Y P, YANG X H, ZHAI H. Induction of cyclic electron flow around photosystem I during heat stress in grape leaves. Plant Science, 2017, 256: 65-71.

[21] THILMONY R, UNDERWOOD W, HE S Y. Genome-wide transcriptional analysis of the Arabidopsis thaliana interaction with the plant pathogenpv.DC3000 and the human pathogenO157:H7. The Plant Journal, 2006, 46(1): 34-53.

[22] KOCH E, SLUSARENKO A.is susceptible to infection by a downy mildew fungus. The Plant Cell, 1990, 2(5): 437-445.

[23] LEGRAND C, BOUR J M, JACOB C, CAPIAUMONT J, MARTIAL A, MARC A, WUDTKE M, KRETZMER G, DEMANGEL C, DUVAL D, HACHE J. Lactate dehydrogenase (LDH) activity of the number of dead cells in the medium of cultured eukaryotic cells as marker. Journal of Biotechnology, 1992, 25(3): 231-243.

[24] 陳建勛, 王曉峰. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（第二版）. 廣州: 華南理工大學(xué)出版社, 2006: 64-66.

CHEN J X, WANG X F. Guidance of Plant Physiological Experiment (2ndedition). Guangzhou: South China University of Technology Publishers, 2006: 64-66. (in Chinese)

[25] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein- dye binding. Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248-254.

[26] HODGES D M, DELONG J M, FORNEY C F, PRANGE R K. Improving the thiobarbituric acid-reactive-substances assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds. Planta, 1999, 207(4): 604-611.

[27] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCTmethod. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[28] WYRWICKA A, SK?ODOWSKA M. Influence of repeated acid rain treatment on antioxidative enzyme activities and on lipid peroxidation in cucumber leaves. Environmental and Experimental Botany, 2006, 56(2): 198-204.

[29] 姚桃峰, 王潤(rùn)元, 王鶴齡, 趙鴻. 拔節(jié)期模擬酸雨對(duì)春小麥葉片光合特性的影響. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(15): 8069-8073.

YAO T F, WANG R Y, WANG H L, ZHAO H. Stress effects of simulated acid rain on photosynthetic characteristics of field-grown spring wheat at the jointing stage. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2010, 38(15): 8069-8073. (in Chinese)

[30] SUN Z G, WANG L H, CHEN M M, WANG L, LIANG C J, ZHOU Q, HUANG X H. Interactive effects of cadmium and acid rain on photosynthetic light reaction in soybean seedlings. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2012, 79: 62-68.

[31] YU J Q, YE S F, HUANG L F. Effects of simulated acid precipitation on photosynthesis, chlorophyll fluorescence, and antioxidative enzymes inL. Photosynthetica, 2002, 40(3): 331-335.

[32] GABARA B, SK?ODOWSKA M, WYRWICKA A, GLI?SKA S, GAPI?SKA M. Changes in the ultrastructure of chloroplasts and mitochondria and antioxidant enzyme activity inMill. leaves sprayed with acid rain. Plant Science, 2003, 164(4): 507-516.

[33] JOZEF K, BO?IVOJ K, MARTIN B, FRANTI?EK S, JOSEF H. Physiological responses of root-less epiphytic plants to acid rain. Ecotoxicology, 2011, 20(2): 348-357.

[34] CHANDRAMOHAN P, SHAW M W. Sulphate and sulphurous acid alter the relative susceptibility of wheat toand. Plant Pathology, 2013, 62(6): 1342-1349.

[35] 袁志文. 酸雨與馬尾松病害的發(fā)生調(diào)查初報(bào). 生態(tài)學(xué)雜志, 1988, 7(5): 50-52.

YUAN Z W. Acid rain and the occurrence of diseases in. Chinese Journal of Ecology, 1988, 7(5): 50-52. (in Chinese)

[36] YANG A J, ANJUM S A, WANG L, SONG J X, ZONG X F, LV J, ZOHAIB A, ALI I, YAN R, ZHANG Y, DONG Y F, WANG S G. Effect of foliar application of brassinolide on photosynthesis and chlorophyll fluorescence traits ofunder varying levels of shade. Photosynthetica, 2018, 56(3): 873-883.

[37] JIN S H, LI X Q, WANG G G, ZHU X T. Brassinosteroids alleviate high-temperature injury inseedlings via maintaining higher antioxidant defence and glyoxalase systems. AoB Plants, 2015, 21(7): plv009.

[38] 陸曉民, 陳勇, 貢偉, 陳運(yùn)梅. 油菜素內(nèi)酯對(duì)毛豆幼苗生長(zhǎng)及其抗?jié)n性的影響. 生物學(xué)雜志, 2006, 23(3): 37-38.

LU X M, CHEN Y, GONG W, CHEN Y M. Effect of brassinolide on the seedling growth and water logging resistance of soybean.Journal of Biology, 2006, 23(3): 37-38. (in Chinese)

[39] KUREPIN L V, JOO S H, KIM S K, PHARIS R P, BACK T G. Interaction of brassinosteroids with light quality and plant hormones in regulating shoot growth of young sunflower andseedlings. Journal of Plant Growth Regulation, 2012, 31(2): 156-164.

[40] YOSHIDA K, HISABORI T. Determining the rate-limiting step for light-responsive redox regulation in Chloroplasts. Antioxidants, 2018, 7(11): 153-160.

[41] LUO X M, LIN W H, ZHU S W, ZHU J Y, SUN Y, FAN X Y, CHENG M L, HAO Y Q, OH E, TIAN M M, LIU L J, ZHANG M, XIE Q, CHONG K, WANG Z Y. Integration of light and brassinosteroid- signaling pathways by a GATA transcription factor in. Developmental Cell, 2010, 19(6): 872-883.

[42] WHITNEY S M, HOUTZ R L, ALONSO H. Advancing our understanding and capacity to engineer nature’s CO2-sequestering enzyme, Rubisco. Plant Physiology, 2011, 155(1): 27-35.

[43] NAKASHITA H, YASUDA M, NITTA T, ASAMI T, FUJIOKA S, ARAI Y, SEKIMATA K, TAKATSUTO S, YAMAGUCHI I, YOSHIDA S. Brassinosteroid functions in a broad range of disease resistance in tobacco and rice.The Plant Journal, 2003, 33(5): 887-898.

[44] XIONG J, HE R, YANG F, ZOU L, YI K, LIN H, ZHANG D. Brassinosteroids are involved in ethylene-inducedDC3000 resistance in. Plant Biology, 2020, 22(2): 309-316.

[45] 劉慶. 24-表油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)葡萄抵抗霜霉病和灰霉病的研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2016.

LIU Q. Effct of 24-epibrassinolide induced resistance of grapevine against downy mildew and grape against grey mould [D]. Yangling: Northwest A&F University, 2016. (in Chinese)

[46] YAN H J, ZHAO Y F, SHI H, LI J, WANG Y C, TANG D Z. Brassinosteroid-signaling kinase1 phosphorylates MAPKKK5 to regulate immunity in., 2018, 176(4): 2991-3002.

Effects of Simulated Acid Rain Conditions on Plant Photosynthesis and Disease Susceptibility in Tomato and Its Alleviation of Brassinosteroid

LI JianXin, WANG WenPing, HU ZhangJian, SHI Kai

College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058

【】In the era of climate change, the acid rain deposition has become a global environmental issue, which seriously affects the yield, quality and disease incidence of vegetables and other crops. Brassinosteroids (BRs) are a group of plant hormones widely existing in plants, which regulate plant resistance to broad-spectrum environment stresses. The aim of this study was to investigate effects of BRs on plant photosynthesis and disease susceptibility in tomato under simulated acid rain conditions and its alleviation effect, so as to provide guidance for safety production of vegetable crop.【】In this study, using tomato (L.) cultivar ‘Hezuo 903’ as material, the effects of exogenous BR foliar spray on the photosynthetic characteristics and the incidence of bacterial leaf spot disease caused bypv.DC3000 (DC3000) were studied under two levels of simulated acid rain including simulated acid rain 1 (SiAR2): NH4NO3(1.3 g·L-1)，MgSO4·7H2O (3.1 g·L-1)，Na2SO4(2.5 g·L-1)，KHCO3(1.3 g·L-1)，CaCl2·2H2O (3.1 g·L-1)， pH (3.0, adjusted by 1N H2SO4) and simulated acid rain 2 (SiAR2): rain from Hanzhou area in spring, pH (3.0, adjusted by 1N H2SO4), and spraying leaves with H2O as control condition. Thealleviation of exogenous BR were studied through spraying exogenous BR on tomato leaves under two levels of simulated acid rain and control conditions. To reveal the underlying mechanism of BR induced stress alleviation, the transcript abundance of photosynthesis-related genes (e.g.), defense-related genes (e.g.and), and the activity of antioxidant enzymes weremeasured.【】The results showed that the phytotoxic effect of simulated acid rain on photosynthesis in tomato was mainly reflected by the decrease of net photosynthesis rate (Pn), the photosystem II photochemical efficiency (ΦPSII), and the photochemical quenching coefficient (qP). The simulated acid rain increased tomato susceptibility toDC3000, resulting in a significant increase in disease incidence and leaf bacterial population. However, the exogenous BR was able to enhance the leaf photosynthetic capacity and decrease the susceptibility of tomato toDC3000 by reducing the leaf bacterial population under two levels of simulated acid rain and control conditions Furthermore, the exogenous BR treatment was able to protect plant photosynthesis and pathogen resistance from the damages caused by simulated acid rain. The BR pretreatment not only significantly increased the transcript abundance of photosynthesis-related genes (e.g.e, SBPase, a) and defense-related genes (e.g.and), but also reduced the content of malondialdehyde and enhanced the activity of G-POD and CAT in tomato plants under simulated acid rain treatments.Thus, the exogenous BR alleviated the inhibition of simulated acid rain on tomato photosynthesis and disease resistance.【】It was concluded that exogenous BR could increase leaf photosynthesis, transcript abundance of photosynthesis,defense-related genes, and the activity of antioxidant enzymes under simulated acid rain, and could also improve the resistance of tomato plants to bacterial leaf pathogen.

tomato; acid rain; brassinosteroid; photosynthesis; bacterial leaf spot

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.08.012

2020-07-04；

2020-11-13

浙江省自然科學(xué)基金杰出青年項(xiàng)目（LR19C150001）、浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021C2040）

李建鑫，E-mail：1123819253@qq.com。通信作者師愷，E-mail：kaishi@zju.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）