HPLC法測定可溶性微針中草烏甲素的含量*

李銳婷，李麗云，孫文強，丁江生**

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；3.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室，云南 昆明 650111)

Fund: Supported by Yunnan Special Resources Health Food and Functional Food Development Project (2019DC008)

Keywords:bulleyaconitine A; dissolving microneedle; HPLC; content determination

草烏甲素為毛茛科烏頭屬植物龍頭烏頭(Aconitum Longtounense T.L.Ming)中提取分離出來的二萜雙酯生物堿，又名滇西嘟拉堿甲(bulleyaconitine A) 。草烏甲素具有良好的鎮(zhèn)痛、抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用，是我國自主研發(fā)的新型第三類鎮(zhèn)痛藥物，其鎮(zhèn)痛作用分別是嗎啡的65倍和阿司匹林的7000倍，較非甾體消炎鎮(zhèn)痛藥和阿片類鎮(zhèn)痛藥有顯著的無耐受性、成癮性優(yōu)勢[1]。

微針(microneedle)是指直徑小于幾十微米、長度為25～2 000 μm 的針狀結(jié)構(gòu)[2]，是一種新型的透皮給藥系統(tǒng)，通過刺穿皮膚上層組織進(jìn)行給藥，無破壞性皮膚損傷和疼痛感。可溶性微針(Dissolving Microneedle，DMN)是微針中的一類，由水溶性高分子材料制備而成，具有給藥效率高、安全性好、生物相容性好等優(yōu)勢，現(xiàn)已廣泛用于多種藥物的經(jīng)皮給藥研究，如小分子藥物[3-4]、大分子類藥物[5]、疫苗[6]等。本課題組選取草烏甲素為模型藥物，以聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)和透明質(zhì)酸(HA)為基質(zhì)，制備具有鎮(zhèn)痛作用的可溶性微針。

目前，HPLC法已廣泛用于各種藥物的定量分析，但采用HPLC法測定可溶微針貼片中藥物含量的報道較少[7-8]。本實驗采用HPLC法測定可溶性微針貼片中草烏甲素的含量，旨在建立一種準(zhǔn)確可行的含量分析方法，為后續(xù)可溶性微針的質(zhì)量研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器、試藥與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國Agilent公司)；紫外可見光分光光度計(Evolution 300，賽默飛世爾公司)；電子天平(EX 125 ZH，奧豪斯儀器有限公司)；電子天平(1225020258，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；超純水機(ADVANTAG A10， 默克密理博)。

1.2 試藥與試劑

草烏甲素可溶性微針貼片(本研究組自制) ；草烏甲素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100530-201502,純度：99.5%)；透明質(zhì)酸(HA，華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司，批號：1906173)；聚乙烯基吡咯烷酮(PVP K30，博愛新開源醫(yī)療科技集團股份有限公司，批號：C200210012)；乙腈為色譜級，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ecosil 120-5-C18EPS(5 μm，4.6×250 mm)；流動相：0.2%三乙胺(磷酸調(diào)pH值3.1±0.1)-乙腈(體積比，60∶40)；檢測波長為260 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL；柱溫：30 ℃。理論塔板數(shù)按草烏甲素峰計算不低于3 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 草烏甲素對照品溶液的制備

精密稱取草烏甲素對照品粉末20.02 mg，置于100 mL容量瓶中，使用混合均勻的流動相溶液溶解并定容至刻度，作為對照品貯備溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

將自制的草烏甲素可溶性微針每片溶于1 mL 35%的乙醇中，溶解完全后作為供試品溶液。

2.2.3 陰性溶液的制備

精密稱取PVP K30 0.300 g、HA 0.200 g，置于10 mL容量瓶中，使用35%的乙醇溶解、定容，分別制成30.00 mg/mL、20.00 mg/mL的溶液。

2.3 專屬性考察

取 2.2 項下對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按 2.1項下方法進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，目標(biāo)成分分離效果好，陰性樣品溶液在對照品溶液和供試品溶液色譜峰相應(yīng)保留時間處均無吸收峰，表明該方法專屬性強。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2.1下的溶液0.1 mL，0.25 mL，0.5 mL，1.0 mL，2.5 mL，5.0 mL，7.5 mL，10.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，加流動相溶液定容。高效液相色譜儀進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以草烏甲素對照品濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，對照品溶液峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果如圖2所示，得到Y(jié)= 32.942X- 34.539，R2=0.999 7(n=8)。結(jié)果表明，草烏甲素對照品溶液在2.002～200.200 μg/mL濃度范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

A.草烏甲素對照品溶液色譜圖；B.HA溶液色譜圖；C.PVP K30溶液色譜圖； D.草烏甲素可溶性微針溶液色譜圖圖1 草烏甲素、PVP K30、HA、草烏甲素可溶性微針專屬性試驗色譜圖

圖2 草烏甲素對照品溶液線性回歸曲線

2.5 精密度實驗

2.5.1 日內(nèi)精密度

取2.4項下配制的濃度為20.02，50.05，100.10 μg/mL的草烏甲素對照品溶液，按 2.1 項下色譜條件連續(xù)測定3次，記錄峰面積。結(jié)果如表1所示，3個濃度的草烏甲素對照品溶液日內(nèi)精密度較好，平均 RSD 值為0.11%。

表1 草烏甲素的日內(nèi)精密度檢測

2.5.2 日間精密度

取濃度為 20.02，50.05，100.10 μg/mL 的草烏甲素對照品溶液，按2.1項下的色譜條件，于 3 d 內(nèi)每天的相同時段連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄色譜圖。結(jié)果如表2所示，3個質(zhì)量濃度的日間精密度良好，平均RSD值為0.49%。

表2草烏甲素的日間精密度檢測

2.6 加樣回收率實驗

精密量取2.2.3項的HA、PVP K30溶液各0.5 mL制成空白輔料溶液，保持混合輔料濃度不變，加入2.2.1中配制的草烏甲素對照品溶液，分別配制成含草烏甲素對照品質(zhì)量濃度為40.040，50.045，60.060 μg/mL的溶液，將藥物和輔料的混合溶液過濾后注入高效液相色譜儀進(jìn)樣分析，記錄峰面積，代入回歸方程計算濃度。結(jié)果如表3所示，草烏甲素的平均加樣回收率在98.78%～100.24%，平均RSD值為0.48%。

表3 草烏甲素加樣回收率實驗

2.7 重復(fù)性試驗

取自制同一批號(20201021)的草烏甲素可溶性微針貼片6片，完全溶解于1 mL 35%乙醇中，過濾后按2.1項的色譜條件進(jìn)樣，計算每片可溶微針貼片中草烏甲素的載藥量。結(jié)果得出平均每片可溶微針貼片中草烏甲素的質(zhì)量為101.48 μg，RSD 為0.59%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取2.7項下某一可溶微針貼片溶液，分別于 0，1，2，4，6，8，10，12，24 h 時間點進(jìn)樣，測定峰面積。草烏甲素可溶性微針貼片溶液8個時間點的峰面積RSD 值為0.10%(n=8)，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 樣品含量的測定

取3個不同批次的草烏甲素可溶性微針，各兩片，按“2.2.2”項下的供試品制備方法制備溶液，按“2.1”項的方法進(jìn)行測定，計算含量。結(jié)果見表4，不同批次的草烏甲素可溶性微針含量在100.28～104.63 μg范圍內(nèi)。

表4 不同批次的草烏甲素可溶性微針質(zhì)量測定

3 討論

草烏甲素不溶于水，易溶于乙醇、乙醚、稀鹽酸等有機溶劑。為減少草烏甲素可溶性微針透皮給藥過程中對皮膚的損傷，本研究采用乙醇作為溶劑，對不同的乙醇(35%，55%，75%)進(jìn)行研究。因HA不溶于乙醇，為保證輔料均能全部溶解，本研究選擇采用低濃度的乙醇作為溶劑。

實驗前期采用紫外可見分光光度計對草烏甲素對照品溶液在200～900 nm 進(jìn)行全光譜掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)草烏甲素在260 nm 處有最大吸收，與《中國藥典》2020版二部中的草烏甲素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢查中的檢測波長一致[9]，且使用HPLC檢測藥物含量時輔料PVP K30、HA 在260 nm處對草烏甲素峰無干擾，專屬性良好，故檢測波長選擇260 nm。

本研究建立了利用HPLC測定可溶微針中草烏甲素含量的方法，此方法簡單可行，專屬性強、精密度良好、重復(fù)性較好，結(jié)果可靠。目前，國內(nèi)外藥典均未有微針的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文可作為評價草烏甲素可溶微針貼片的質(zhì)量方法，為鎮(zhèn)痛可溶性微針貼片的研究提供方法依據(jù)。