露水草中β-脫皮激素的提取及測定

徐艷飛，裴云逸，李本發，李康銀，徐冬梅

(1.玉溪農業職業技術學院，云南 玉溪 653106;2.昆明市第二十四中學，云南 昆明 650101)

露水草(Cyanotis arachnoidea C.B.Clark) 又名珍珠露水草、換肺散、雞冠參等，為鴨趾草科(Commelinaceae) 藍耳草屬(Cynanotis D Don)多年生宿根性草本，分布于中國、印度、斯里蘭卡及中南半島。我國主要分布于云南、貴州、廣西、廣東、福建、臺灣等省( 區) 海拔1 100～ 1 700 m 的山溝、山坡林緣或林中[1]。露水草以根入藥，夏秋采收(洗凈，鮮用或曬干)。其味甘、性平，具有舒筋活絡、補虛除濕、退虛熱、通經、止痛等功效。露水草可用于風濕性關節炎、四肢麻木等癥狀，能促進蠶、蝦、蟹生產脫皮等，具有降低人體內膽固醇、降低血糖濃度等功效。昆明植物研究所聶瑞麟先生發現，迄今為止，露水草是自然界中含植物甾酮類成分最豐富的藥用植物之一[2]。其提取物中的β-蛻皮激素具有很多良好的藥理活性。β-蛻皮激素(β-ecdysone)又稱β-蛻皮甾酮或者20-羥基蛻皮甾酮(20-Hydroxy ecdysterone)，是一種昆蟲的變態激素，可用于防治害蟲及提高蝦蟹產量[3]，化學式為 C27H44O7[4]。研究表明，β-蛻皮激素能促進核酸和蛋白質的合成[5]，影響糖代謝和脂類代謝[6]，調節機體免疫[7]，提高乙酰膽堿酯酶的活性[8]等。廣泛用于養殖、保健、化妝品、醫藥行業等。

目前，對β-脫皮激素的研究大多數集中在以下幾個方面，一是提取工藝研究。有恒溫提取、超聲提取、震蕩提取等。二是含量測定。三是蛻皮激素的生物活性及藥理研究。本實驗以蒸餾水為提取劑，采用恒溫水提、超聲水提和微波水提，結合HPLC標準曲線法測定露水草提取物中β-脫皮激素的含量，比較恒溫水提、超聲水提和微波水提的提取效果，以便工業生產參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

露水草(產自云南省紅河州石屏縣龍武鎮，由石屏興興生物有限責任公司提供)，β-蛻皮激素標準品(Purity HPLC：99.9%，上海安譜試驗科技股份有限公司)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，95%乙醇(分析純)，屈臣氏蒸餾水，純化水(玉溪農業職業技術學院實驗室自制)。

1.2 儀器設備

高效液相色譜分析儀(島津LC-10AT/SPD10A)；色譜工作站(LabSolutions LCsolution)，紫外可見分光光度計(UV-2550)；超聲波清洗器(KQ5200E)；微波爐(MZ-68ES)；電子天平(BT2202S，北京賽多利斯儀器有限公司) ；離心機(LD5-2A)；超微濾膜(津騰50×0.22 μm)；家用多功能料理機(CX-301，中山市九陽小家電有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將2019年1月采收自云南省紅河州石屏縣龍武鎮人工栽培的新鮮露水草植物根洗凈，陽光暴曬數天至干燥，用破壁機(料理機)打粉，備用。

1.3.2 樣品提取方法

咨詢生產企業水煮法提取經驗(1噸粉狀露水草在 80 ℃ 左右的儲罐中加水煮 3 h，放出提取液冷卻，再加水煮 2 h，合并提取液，再分離純化得β-蛻皮激素粗品)，并結合文獻推測。本實驗采用80 ℃恒溫水浴提取，超聲水提和微波水提取三種方法，并考察采用何種方法提取效果更好。

1.3.3 最大吸收波長的確定

取β-蛻皮激素標準品1支(20 mg/支)，用95%乙醇溶解并用純化水定容至 20 mL 得質量濃度為 1 mg/mL 的標準品貯備液。取上述貯備液用純化水稀釋配制成質量濃度為 0.2 mg/mL 的標準品溶液。以95%乙醇為對照，用紫外分光光度計進行光譜掃描。對露水草提取液同法試驗，確定最大吸收波長為 243 nm。

1.3.4 流動相的確定

預實驗時標準品的處理：取1.3.3所得的質量濃度為 1 mg/mL 的標準品貯備液,稀釋到 0.2 mg/mL 用針孔濾膜(0.22 μm)過濾得到標準品溶液。

預實驗時樣品溶液的處理：準確稱取 0.2057 g 露水草粉末，置于 250 mL 燒杯中，加 50 mL 純化水，超聲提取 20 min，離心 20 min，取上層清液定容至 100 mL。取一定量用針孔濾膜(0.22 μm)過濾的質量濃度為 0.2057 mg/mL 的樣品溶液。

將上述得到的標準品溶液和樣品溶液分別在檢測波長為 243 nm，流動相分別為乙腈-水、甲醇-水、乙腈-甲醇-水，在不同體積比條件下進樣檢測。通過對比分離效果、保留時間、色譜峰峰形及峰面積，發現乙腈-水為70∶30時(體積比，下同)，分離效果好，但保留時間稍長；甲醇-水為40∶60時，分離效果好，保留時間也稍長；乙腈-甲醇-水體積比為1∶2∶4時，分離效果差；乙腈-甲醇-水體積比為1∶3∶4時(A泵：乙腈-水1∶4；B泵：甲醇)，保留時間短，分離效果較好，峰形較好，峰面積較穩定。所以確定后期實驗以乙腈-甲醇-水體積比1∶3∶4為流動相。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend-C18 ODS柱(4.6 mm×150 mm，粒徑 5 μm) ；柱溫 30 ℃；流動相為乙腈-甲醇-水(1∶3∶4)；流速 1.0 mL/min；進樣量 10 μL；檢測波長 243 nm。在此色譜條件下，0.2 mg/mL β-蛻皮激素標準品 3.320 min 出峰(圖1)，0.2057 mg/mL 露水草提取液樣品在 3.330 min 處有最大峰(圖2)。

圖1 β-蛻皮激素標準品色譜圖(0.2 mg/mL)

圖2 露水草提取液樣品色譜圖(0.2057 mg/mL)

1.4 溶液的配制

1.4.1 標準品溶液

取β-蛻皮激素標準品1支(20 mg/支)，用95%乙醇溶解并用純化水定容至 20 mL 得質量濃度為 1 mg/mL 標準品貯備液。取標準貯備液用純化水稀釋配制為0.10,0.15，0.20，0.25，0.30 mg/mL 的β-蛻皮激素標準系列溶液，用針孔濾膜(0.22 μm)濾過備用。

1.4.2 樣品溶液

1)恒溫(80 ℃)水浴提取樣品溶液

精密稱取露水草粉末樣品 0.221 1 g、0.316 2 g、0.548 8 g，分別置于三個 250 mL 燒杯中，各加入 50 mL 純化水。置于 80 ℃ 恒溫水浴加熱時間 50 min ，取出冷卻至室溫，設置離心機(LD5-2A)轉速為 5 000 r/min，離心 20 min，取上層清液用純化水定容至 100 mL。用針孔濾膜(0.22 μm)過濾得質量濃度為 2.211 mg/mL， 3.162 mg/ mL， 5.488 mg/mL 的三份供試品溶液，置于液相色譜進樣瓶待測。

2)超聲提取樣品溶液

精密稱取露水草粉末樣品 0.205 7 g，0.319 8 g，0.411 3 g 置于三個 250 mL 燒杯中，加 50 mL 純化水。室溫超聲提取 20 min，離心 20 min，取上層清液定容至 100 mL。取一定量用針孔濾膜(0.22 μm)過濾得質量濃度為 2.057 mg/mL, 3.198 mg/mL,4.113 mg/mL 的三份供試品溶液，置于液相色譜進樣瓶待測。

3)微波提取樣品溶液

精密稱取露水草粉末樣品 0.206 6 g，0.320 9 g，0.412 9 g 置于三個 500 mL 高燒杯中，加 50 mL 純化水。微波提取1 min，冷卻離心20 min，取上層清液定容至100 mL。取一定量用針孔濾膜(0.22 μm)過濾得質量濃度為2.066 mg/mL，3.209 mg/ mL，4.129 mg/mL的三份供試品溶液，置于液相色譜進樣瓶待測。

2 結果與討論

2.1 水煮法提取時間

精密稱取0.534 6 、0.539 4 、0.541 7 、0.549 8 、0.548 8 、0.541 5 、0.549 0 g 露水草粉末樣品，分別置于7個250 mL燒杯中，各加入50 mL純化水。置于80 ℃恒溫水浴加熱，時間分別為：10、20、30、40、50、60、70 min。取出冷卻至室溫，用5 000 r/min，離心20 min，取上層清液用純化水定容至100 mL。用針孔濾膜(0.22 μm)過濾得樣品溶液，每份進樣3針，結果見表1。

由表1看出，加熱50～60 min，峰面積最大，60 min后下降。由此得出，加熱時間控制在50～60 min，提取效果較好。

表1 80℃恒溫水浴提取測定結果

2.2 重復性試驗

取上述恒溫(80 ℃)水浴提取50 min所得溶液5份(5.488 mg/mL)，按上述色譜條件測定，每份進樣3針。結果β-蛻皮激素的峰面積無明顯差異，其相對標準偏差RSD值為0.62%(<2%)，表明該方法重復性良好。結果見表2。

表2 水提樣(5.488 mg/mL)峰面積測定結果

2.3 加標回收率試驗

精密稱取5.018 0 g露水草粉末，加50 mL蒸餾水，80 ℃恒溫水浴加熱55 min，冷卻離心取上層清液定容至250 mL。精密移取50 mL上述樣品溶液4份(每份含供試品1.0036 g)定容至200 mL，分別加入1 mg/mL的標品溶液0 、1、2、3 mL。用針孔濾膜(0.22 μm)過濾，按上述色譜條件測得回收率介于100.00%～103.00%，RSD值為1.48%(<2%)，表明回收率良好，結果見表3。

表3 加標回收率測定結果

2.4 標準品線性范圍的確定

將1.4.1得到的質量濃度為0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mg/mL的標準系列溶液，與1.3.4中得到的2.057 mg/mL樣品溶液在上述色譜條件下，每份進樣3針，求平均峰面積。結果見表4。以峰面積A為縱坐標，質量濃度ρ(mg/mL)為橫坐標，繪制標準工作曲線。如圖3。β-蛻皮激素標準溶液在0.10～0.30 mg/mL 范圍內，峰面積與濃度呈良好的線性關系。所得回歸方程為A=12 703 408.666 7ρ+141 220.533 3，r2=0.999 5。

表4 標準品峰面積測定結果

圖3 β-蛻皮激素0.10～0.30 mg/mL系列標準溶液標準曲線

2.5 儀器精密度實驗

精密吸取0.2 mg/mL標準品溶液10 μL，重復進樣5次，由峰面積計算RSD值為0.55%(<2%)(表5)。因此，本試驗的的精密度滿足實驗要求。

表5 0.2 mg/mL蛻皮激素標準品峰面積測定結果

3 樣品測定

取1.4.2 節1) 項中的恒溫(80℃)水浴提取樣品溶液3份，按上述色譜條件測定。計算含量(本品含量按干燥品計算)，結果如表6。

表6 恒溫(80 ℃)水提取樣品含量測定結果

取1.4.2 節2) 項中超聲水提所得樣品溶液3份，按上述色譜條件測定。計算含量(本品含量按干燥品計算)，結果如表7。

表7 超聲提取樣品含量測定結果

取1.4.2 節3) 項中微波水提所得所得樣品溶液3份，按上述色譜條件測定。計算含量(本品含量按干燥品計算)，結果如表8。

表8 微波提取樣品含量測定結果

4 結論

本實驗采用露水草根部為原料，蒸餾水作提取劑，采用恒溫(80℃)水浴提取、超聲提取和微波提取，結合HPLC標準曲線法測定露水草根部提取物中β-脫皮激素的含量。恒溫(80℃)水浴提取測得露水草中β-脫皮激素的質量分數為3.73%，超聲提測得露水草中β-脫皮激素的質量分數為3.17%，微波提測得露水草中β-脫皮激素的質量分數為6.02%。可見，微波水提優于恒溫水提和超聲水提。微波水提效果好，工藝簡單，節能，生產效率高，可供工業生產參考。