硼中子俘獲治療人腦膠質瘤的研究進展

馬 彭，董啟珊，陳業高，王麗瓊

(云南師范大學化學化工學院，云南 昆明 650500)

1 人腦膠質瘤的治療現狀和BNCT的概念

人腦惡性神經膠質瘤是人體顱內常見的腫瘤之一，目前的治療方式主要有化療、放療、手術和基因治療等，但效果均不理想。特別是，惡性程度較高的多形性型腦膠質瘤(Giloblastoma Mutiforme，GBM)，由于其浸潤性較高，沒有可以憑借肉眼觀察到的清晰的邊緣，很難通過傳統的方法切除治療，容易復發，中位生存期只有13～17月。因此，從20個世紀50年代開始，BNCT作為一種新的化療方法開始成為人們探索治療癌癥的新方向。

2020年5月，在經過最新21例BNCT臨床試驗后，一年無進展生存率為71%，效果很好，副作用較低，日本南東北醫院(Southern Tohuku Hospital Group)宣布使用BNCT接收治療頭頸部惡性腫瘤患者進行Ⅱ期臨床試驗，對治療的有效性和治療范圍進行深度研究。這一治療成果使BNCT作為一種新的化療方式又引起了廣泛關注[1]。

BNCT是基于在癌細胞的10B原子核反應，利用裂變中產生的高能線密度α粒子(4He)，使之能夠摧毀癌細胞的治療方法。第一步是給病人注射足量的含有10B藥物，使有選擇性的10B大量進入癌細胞中。當癌細胞攝取了含有10B的藥物之后，從外部用能量為0.0253eV的熱中子(1n)照射病變部位，在癌細胞內發生裂變反應，產生了11B和α粒子以及鋰原子。α粒子具有較高的輻射能量，可以殺死癌細胞，同時由于α粒子射程僅10 μm，小于一個細胞的直徑，所以只能殺死癌細胞而不會影響周圍健康的細胞。因著這一原理，BNCT成為一種溫和高效的化療方式(圖1)。

圖1 硼中子俘獲原理

2 BNCT治療的人腦惡性膠質瘤病例研究進展

自20世紀50年代，美國就開始了BNCT的臨床治療實驗，第一例惡性腦瘤患者用Brookhaven Graphite Research Reactor 進行了治療，這是最初采用的中子發射器,后續有數名腦瘤患者參與了治療試驗。當時用于治療的中子源對腦部腫瘤細胞的穿透能力非常弱，而且選用了一些無機硼酸作為注射藥物，非靶向硼化合物不僅在腫瘤細胞中聚集，也在正常細胞中聚集[2-3]。治療后的患者因此產生了強烈的副作用，包括輻射引發的皮膚病、腦水腫、腦梗以及腦細胞壞死等，實驗以失敗告終。1961年，美國停止了BNCT的臨床試驗。

在美國開展這項研究的Hiroshi Hatanaka教授在試驗失敗后回到了日本，并在日本接著開展此項試驗。改進后的試驗直接用中子對顱內腫瘤細胞進行照射，此次試驗讓10%的患者能夠達到5年生存率[4]，10年生存率達到了5.7%。這項研究再次引起了廣泛關注[5-6]。

美國布魯克哈文實驗室在1994—1999年間共治療53例多形性膠質母細胞瘤患者，平均年齡56.5歲，腫瘤大小平均為20.5 cm3，KPS評定為80，總生存期為12.8月。在2005年以后，該實驗室陸續收治了46名腦瘤患者，雖然所有的患者在經過BNCT治療以后都發現腫瘤萎縮變小了，但很多患者最后還是發生了癌細胞轉移至未經輻射的部位。治療效果最好的一個患者預后良好， BNCT治療之后，每兩周用貝伐珠單抗治療，在84月后發現腫瘤完全消失。貝斯以色列醫學中心共收治26例患者，總生存期為11月。

2005年，德國杜伊斯堡-埃森大學[7]試驗了26例患者，總生存期為10.4～13.2月。2011年，芬蘭赫爾辛基中心醫院報導[8]該院共收治復發性腦瘤患者50例，總生存期達到了21.9月。瑞典尼雪平醫院試驗了31例患者，總生存期最高為17.7月。

在1999年至2007年間，日本筑波大學(Yamamoto, Nakai et al.2009, Kageji, Mizobuchi et al.)、德島大學和大版醫科大學[9]共進行了90例惡性腦膠質腫瘤的臨床試驗，其中有多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme),漸變性星型細胞瘤(anaplastic astrocytoma), 間變性少突-星形細胞瘤(anaplastic oligoastrocytoma)，中位生存期從10.8月到27.1月，兩年生存率平均達到了24.1%。

Minoru Suzuki 組[10]用BNCT在2001年到2007年間治療了62例復發頭頸部腫瘤的病例，療效穩定，一年生存率達到41%。Heikki Joensuu 組在赫爾辛基大學醫院對79例之前接受分次放療又復發的患者進行了治療，其中38%的患者可以達到兩年無進展生存期，總生存率為21%。

在中國，Wang Lingwei 組在臺北榮民總醫院對17例患者進行了同樣的治療后發現一年生存率達到56%，兩年局部控制率為28%，兩年生存率為47%[11]。

Iara S.Santa Cruz用RA-6作為中子源對5只患頭頸部腫瘤的寵物狗進行治療，生存壽命延長了8.5月至13.5月，超出了預計的生存時間，取得較好的效果。治療后的結果顯示，所有的病例都有明顯的部分緩解，其中1例腫瘤減小50%。這一結果對人頭頸部腫瘤的治療有重要的借鑒意義。當然，值得注意的是，中子進入腦部的深度只達到了1 cm左右，這是一個讓治療不能充分進行的關鍵因素，其中兩例發現了癌細胞轉移至肺[12]。

日本南東北醫院的近期試驗結果(2019年公布)顯示，全部21例患者中，完全緩解(CR)為5例(23.8%)，部分緩解(PR)為10例(47.8%)，穩定未發展(SD)5例(23.8%)，出現新病灶的為0例，有1例(4.8%)無法評估[13]。

從這些治療的結果來看，日本在頭頸部腫瘤的治療方面取得了重要的進展，而頭頸部腫瘤用BNCT治療的效果總體比腦膠質瘤好。目前腦膠質瘤的臨床Ⅰ、Ⅱ期試驗仍然困難重重，主要的原因還是與藥物無法有效聚集在腦腫瘤細胞和中子未能夠精準到達腫瘤位置有關系。

3 BNCT誘發腫瘤細胞凋亡機理

腫瘤細胞凋亡的機理對于腫瘤治療有著非常重要的意義，對腫瘤細胞的抗凋亡蛋白研究能夠很好地詮釋腫瘤細胞的耐藥性和腫瘤復發。然而，也有觀點認為，沒有證據表明抗腫瘤治療與腫瘤細胞凋亡之間有必然聯系。目前，細胞凋亡機理仍然是研究者關注的熱點之一。本文綜述了部分關于BNCT治療中腫瘤細胞凋亡的研究觀點。

大部分射線進入生物體內都有化學輻射反應，中子也不例外，直接的離子射線靶點是DNA。除此以外，研究表明在照射中產生的自由基和離子碎片可以破壞一些生物大分子如核酸、蛋白質、脂類和多糖等[14]。這些大分子的改變對于BNCT作用于腫瘤細胞的機理也產生了不同的影響。在治療過程中發現，腫瘤細胞中的染色體異常比傳統的化療方式更多，致死率更高。同時發現BNCT能通過Bcl-2/Bax途徑和線粒體調控細胞色素C的釋放和Caspase-9的激活來加速腦腫瘤細胞凋亡[15]。超熱中子能夠讓50%的DNA發生鏈斷裂，同時隨著10B在細胞內濃度的增加，DNA單鏈或者雙鏈斷裂的傾向更大。后續研究發現，在BNCT的治療中，自噬內吞作用是由變異基因Beclin1，PARK2和PINK1引發的[16]。從目前的研究來看，用BNCT治療以后的細胞凋亡機理仍然處于探索階段。

4 硼中子俘獲治療的藥物研究進展

在開展BNCT 的研究過程中，含硼藥物的選擇非常重要，基于半個世紀的研究結果與數據，很多的含硼藥物被研究者合成出來。從治療的過程來看，BNCT對含硼藥物需要達到一下基本要求：

1)含硼藥物一般通過滴注的方式進入患者體內，要求10B在腫瘤上的聚集達到10～30 μg/g，并且有一定的停留時間，能夠使中子充分到達腫瘤內部發揮作用。

2)含硼藥物必須對腫瘤細胞有較高的選擇性，也就是10B在腫瘤細胞和正常組織、血液中的分配比例(T/N值，T/B值)至少要達到3以上。

3)高水溶性和低毒性。

從1990年開始，用于臨床試驗的有效的含硼藥物主要是BSH(polyhedral boron anion, sodium mercaptoundecahydro-closododecaborate,Na2B12H11SH)和BPA((l)-4-dihydroxyborylphenylalanine)兩種(圖2)。BSH不能透過血腦屏障，當血腦屏障被破壞的時候，BSH可以進入并有效地聚集在腦腫瘤部位。而BPA則可以順利通過血腦屏障進入顱內，但是有小部分BPA停留在正常細胞中，多余的BPA在患者尿液中代謝出來并結晶引起發燒，后來用增加給水的方式來預防[17]。雖然后續有很多含硼藥物被設計合成出來，然而現在進入臨床試驗的還是這兩種較早開發的藥物。

圖2 BSH 與 BPA 的化學結構式

日本南東北醫院使用的含硼試劑為Steboronine(9 000 mg/300 mL靜脈注射)，分子結構為(S)-2-amino-3-[4-(10B)dihydroxyboranyl phenyl]propanoic acid(S-BPA)。主要的副作用為脫發癥90.5%(19/21例)、淀粉酶增加85.7%(18/21例)、惡心81.0%(17/21例)、味覺異常71.4%(15/21例)、腮腺炎以及食欲減退66.7%(14/21例)、口腔炎61.9%(13/21例)。

現在有很多研究者都致力于開發新型的含硼試劑，并將其應用于BNCT中。如硼代卟啉[18-20]，H2OCP對人喉癌HEp2細胞不敏感，但是能夠聚集在人腦膠質瘤細胞T98G中，在3 h內細胞攝取率達到了0.03 μmol/1 000細胞[19](圖3，H2OCP，Octa-anionic 5,10,15,20-tetra[3,5-(nidocarboranylmethyl) phenyl]porphyrin)。銨鹽基團的引入是化合物能夠進入細胞內并快速聚集的關鍵(圖3，卟啉銨鹽)，后續研究發現卟啉主要通過內吞作用集中在溶酶體中。

很多新的硼代葡萄糖[21]，硼代多糖[22]，硼代核酸[23]，硼代抗體[24]，硼代磷脂和硼代氨基酸[25]等都被合成并探索了它們的藥物活性(圖3)。

圖3 BNCT含硼化合物

如以表皮生長因子(EGFR)介導的單克隆抗體(mAbs)，cetuximab(IMC-C225),和EGFRvIII的L8A4抗體，實際操作中使用PAMAM聚酰胺胺型樹枝狀高分子聚合物作為載體，將網狀硼烷Na(CH3)3NB10H8NCO和單抗偶聯在一起，能夠通過識別腫瘤細胞中過度表達的EGFR或者變異的EGFRvIII蛋白來達到輸送硼試劑的目的，檢測發現T/N比例為9.9，硼的聚集濃度達到了24.4μg /g(藥物/腫瘤)，達到含硼試劑的基本要求[26]。

2020年Takao Tsurubuchi組上報導了一個新的BNCT候選藥物，結構如圖3中的MMT1242。該化合物在CT26小鼠結腸癌細胞、B6-F10小鼠皮膚黑色素瘤和C6大鼠膠質瘤細胞中都有較高的攝取率，是BPA的兩倍以上。同時，小鼠試驗顯示，此藥物在腫瘤上的停留時間在60 min以上，具備了BNCT治療的理想條件。同時發現，在化合物進入腫瘤細胞24 h之后，此化合物已經表現出中等抗癌活性，對BNCT的治療更添助力[27]。

5 目前治療中存在的問題

1)從使用量來看，一次治療的劑量為靜脈注射 9 000 mg，這是一個很大的量，因此引發的副作用也不可小覷。從日本南東北醫院的治療方案來看，21例患者全部都有不同類型，不同程度的副作用出現。因此改進含硼藥物的結構，提高治療效率，減少治療用量，減少副作用仍然是一個具有挑戰性的課題。

2)雖然基于不同靶點和機理的含硼化合物都被設計出來，但是在初期生物活性試驗或后期的動物試驗中的結果都不理想，因此，這些藥物前體結構都有待進一步改進和提高。

3)含硼化合物進入腦腫瘤之前必須通過血腦屏障(BBB)，而BBB的存在使很多藥物的進入都非常困難。雖然，有研究者發現甘露醇[28]和Cereport[29]可以破環血腦屏障，協助藥物進入腫瘤細胞。然而，甘露醇的操作有一定的副作用，而Cereport雖然增加了BBB的滲透性，卻沒能提高BPA在腫瘤細胞上的聚集率。后續沒有看到此類報告，因此，提高含硼化合物的血腦屏障滲透性仍然是一個重要的研究方向。

6 總結與展望

作為一個新的化療體系，每一個環節都決定著最后的療效以及患者預后狀態。因此，除了前面提到的有效含硼藥物的研究開發問題，建立BNCT需要的條件設備如中子產生裝置和治療中硼濃度的檢測等問題都是需要設計考慮的。

在BNCT的治療過程中，國際原子能機構對中子源有較高的要求。在1 h內，超熱(0.5 eV～10 keV)中子流必須以大于1×109n/cm2/s的量進入腫瘤細胞內，才能達到有效治療的目的。最初在布魯克哈文實驗室使用的鈾反應堆是中子源的提供裝置，我國于 2009 年末建成了世界首座專為 BNCT 應用且可 建在醫院內，由醫療人員自行操控的微型核反應堆中子源 ——醫院中子照射器(IHNI)。目前，中子發生器已經從鈾反應堆發展成為利用質子加速器射出質子與其他原子產生中子的加速器(accelerator-based neutron sources,ABNS)，目前日本南東北醫院的中子產生裝置是由京都大學和住有重工聯合研發的裝置，而這個裝置在提高BNCT的治療方面起著至關重要的作用。這個裝置主要是為了適應臨床診斷和治療的需要，達到了安全、緊湊、穩定和經濟的要求。

除了開發高效的含硼藥物和中子加速器之外，一個很緊迫的臨床治療需求就是含硼藥物進入人體后的實時檢測方法。含硼藥物進入人體后到達腫瘤組織的時間、濃度和T/N比例等因素在臨床治療中非常重要。從1980年以來，人們一直用BPA-F(18F boronophenylalnine)標記藥物并聯合PET(Postiron Emission Tomography,正電子發射計算機斷層顯像)儀器使治療過程中人體內硼濃度得以監測。但是這個過程需要一定時間才能完成，無法及時準確地指導對腫瘤部位進行照射。因此，實時檢測方法也是亟待解決地問題之一。

在這些化合物的開發研究中，大部分研究者把DNA作為目標靶點來進行設計。本課題組在研究中發現，線粒體作為人體的能量中心，它的作用并不只是產生ATP作為能量，它是生命活動控制中心，不僅是是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且在誘發細胞凋亡的信號轉導中有至關重要的中樞調控作用。當凋亡信號被發出時，線粒體外膜通透性增強，一些凋亡因子如細胞色素等由線粒體膜間隙釋放到胞漿中，啟動凋亡進程，死亡受體途徑一旦被打通，這個進程是不可逆轉的。當研究的焦點是把一些代謝產物作為藥物靶點時，線粒體的真正功能也被忽視了。實際上隨著線粒體機制的研究深入發現，幾乎所有導致細胞凋亡的因素都使線粒體結構被破壞，發生功能障礙。究竟是哪個過程發生在前面，還是同步進行，現在的研究還未能給出答案。因此我們致力于開發以線粒體為靶點的BNCT藥物開發研究。目前已經發現并合成了幾類能夠進入線粒體并產生抗癌效應的小分子硼代化合物，為研究BNCT的先導化合物開辟一個新的方向。后續研究正在進行中。