1例豬鏈球菌5型感染者分離菌的病原學(xué)診斷、分型及相關(guān)基因的檢測

李曲文,羅宏活，黃夢穎，謝芳欽，林震宇，徐海濱，翁順太

豬鏈球菌最早見于荷蘭 (1951)和英國(1954)報道，是一種能引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi) 膜炎、敗血癥和肺炎的病原菌，并可以引起人的感染，是一種呈世界廣泛分布的人獸共患病[1]。 豬鏈球菌根據(jù)莢膜多糖抗原的不同共分為33個血清型。在豬和人體以豬鏈球菌血清型2型最常被分離到且是致病力最強，不同的血清型也不斷的被發(fā)現(xiàn)可以引起人的感染，如血清1/2 、7 、9 、14，31 等也能引起人豬鏈球菌感染[2]。本文通過實驗室診斷對1例豬鏈球菌5型的病例進行診斷及分子分型分析，闡述如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 菌株分離來自福建三明鄧某某血液培養(yǎng)分離菌株。

1.2主要試劑和儀器 血平板、VITEK2全自動微生物分析系統(tǒng)、GP卡、革蘭染色液購自廣東環(huán)凱公司，α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)(HCCA)購自德國 Bruker 公司，甲酸、乙腈和三氟乙酸購自美國Sigma 公司。 分子生物學(xué)試劑購自TaKaRa寶生物工程有限公司，引物序列及測序均由鉑尚生物技術(shù)有限公司完成，MALDI-TOF MS -Microflex TM LT 型(德國Bruker公司)。

1.3方法 通過血培養(yǎng)分離可疑菌株，并對分離菌株進行涂片革蘭染色鏡檢及常規(guī)的生化鑒定以及常規(guī)PCR鑒定豬鏈球菌屬基因(16SrRNA)、豬鏈球菌33(1～31型,33型,1/2型)種血清型基因鑒定；豬鏈球菌毒力相關(guān)的谷氨酸脫氫酶(gdh)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、胞外因子(ef)、溶血素(sly)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (gapdh)、纖連蛋白/血纖蛋白原結(jié)合蛋白(fbps)及毒力相關(guān)序列(orf2)等基因、質(zhì)譜鑒定等等。MLST分型用PCR擴增aroA、cpn60、dpr、gki、mutS、recA、thrA，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳后測序。序列經(jīng)提交MLST網(wǎng)站(http://pubmlst.org/ssuis/)，確定序列分型(SequenceType,ST)型別，各基因引物序列見表1、表2，參考文獻[3-5]。

表1 豬鏈球菌基因檢測引物Tab.1 Primers for gene detection of Streptococcus suis

表2 7個管家基因引物Tab.2 Primers for seven housekeeping genes

2 結(jié) 果

2.1革蘭染色結(jié)果 革蘭陽性球菌

2.2生化鑒定 VITEK2 GP 卡，89%為豬鏈球菌1型/87%豬鏈球菌2型。

2.3基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜 (MALDI-TOF- MS)鑒定結(jié)果：鑒定分值 (ScoreValue)為2.03(極好的鑒定為豬鏈球菌)。質(zhì)譜峰圖見圖1。

圖1 質(zhì)譜峰形圖 Fig.1 Peak shapes of the mass spectrum

2.4藥敏實驗結(jié)果 對氨芐西林、氨芐青霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、利奈唑胺、萬古霉素、替加環(huán)素等抗生素體外藥敏實驗均為敏感；而對氯霉素和四環(huán)素兩種藥物顯示為耐藥。

M:DL2000;1.16S rRNA；2.cps5；3.ef；4.mrp；5.sly；6.gdh；7.gapdh；8.fbps；9.orf2圖2 豬鏈球菌的檢測電泳圖Fig.2 Electropherogram of Streptococcus suis detection

2.5豬鏈球菌相關(guān)基因及毒力基因鑒定結(jié)果 菌株豬鏈球菌相關(guān)基因鑒定結(jié)果：16SrRNA(+)cps5(+)，并經(jīng)與NCBI上豬鏈球菌Cps5序列比對與strain:11538序列100%相似。提示該菌株為豬鏈球菌血清型5型；毒力基因攜帶模式：ef(-)mrp(+)sly(+)gdh(+)gapdh(+)fbps(-)orf2(-)。電泳結(jié)果見圖2、3。

圖3 Cps5序列比對結(jié)果Fig.3 Cps5 sequence alignment results

2.6MLST結(jié)果aroA-cpn60-dpr-gki-mutS-recA-thrA基因等位基因譜為8-30-5-45-44-22-109，經(jīng)比對序列分型，型別為ST373。7個基因電泳結(jié)果見圖4。

M:DL2000;1：aroA;2：cpn60;3：dpr;4：gki;5：mutS;6：recA;7：thrA圖4 MLST電泳圖Fig.4 Electropherogram of MLST

3 討 論

豬鏈球菌是一種可以從豬傳染人的病原體，主要通過皮膚傷口感染。雖然豬鏈球菌有33個血清型，但并不是所有的血清型都能引起人的感染，2型是最常見的致病血清型，也是我國主要的流行菌株，但其他血清型如1，1/2，7，9，31等均有陸續(xù)的報道人感染豬鏈球菌[6-8]。對菌株的快速、準確鑒定以及相關(guān)的分子診斷分析對于疫情處置和臨床診療具有重要的臨床意義。

如何快速的對分離株的鑒定是實驗室首要任務(wù)，通過傳統(tǒng)的細菌常規(guī)分離培養(yǎng)、生化鑒定該菌株為陽性鏈球菌，VITEK 2-compact分析系統(tǒng)是近年來由梅里埃研發(fā)的可簡便、快速鑒定豬鏈球菌的一種方法。本文中分離到的菌株通過VITEK 2-GP生化鑒定提示89%為豬鏈球菌1型/87%豬鏈球菌2型，為進一步驗證鑒定結(jié)果，經(jīng)MALDI-TOF- MS質(zhì)譜鑒定其鑒定分值為2.03，極好的鑒定結(jié)果判定為豬鏈球菌屬。為進一步了解菌株所屬的血清基因型別，因血清凝集實驗經(jīng)常會出現(xiàn)血清交叉凝集現(xiàn)象，故而本實驗直接經(jīng)常規(guī)PCR進行豬鏈球菌屬基因(16SrRNA)及以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的莢膜分型糖(CPS)對豬鏈球菌的33(1～31型,33型,1/2型)種血清型基因分型結(jié)果為16SrRNA陽性、CPS5陽性，判斷為豬鏈球菌血清型5。

為了解福建省首次分離到的這一株豬鏈球菌5型病例菌株的致病性，分析了ef、mrp、sly、gdh、gapdh、fbps、orf2等毒力基因。由于不同的毒力基因編碼的蛋白具有不同的功能，mrp基因是編碼胞外因子的有助于細菌突破血腦屏障，而ef是一種粘附素，能黏附上皮細胞并誘導(dǎo)上皮細胞融合和凋亡，MRP和EF是判斷豬鏈球菌其毒力強弱的重要毒力因子，本次分離到的菌株為mrp+/ef-/,表明該菌株為弱毒株；sly基因編碼的溶血素是具有溶血活性且可破壞微血管內(nèi)皮細胞和上皮細胞，有利于細菌在組織中的侵襲擴散，同時谷氨酸脫氫酶(GDH)是細菌能量代謝的一個重要分子，也是診斷豬鏈球菌感染的一個重要診斷因子和具有免疫保護抗原。甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (GAPDH)是一種糖酵分解反應(yīng)酶，具有增強細胞骨架結(jié)構(gòu)、促進細菌與宿主細胞之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[8-9]，sly+/gdh+/gapdh+ 3個基因均為陽性表明菌株具有在感染組織內(nèi)侵襲并導(dǎo)致宿主的致病性。而fbps基因表達的是纖連蛋白和血纖蛋白原的結(jié)合蛋白(fbps)，fbps參與細菌粘附、定植和感染的重要基礎(chǔ)[10]，毒力相關(guān)序列orf2在強弱毒株之間的序列存在差異，這兩個基因均為陰性，這種差異可能與菌株致病性有關(guān)[11]。不同菌株的毒力基因攜帶模式并不一定相同，此次血培養(yǎng)分離株豬鏈球菌毒力基因攜帶模式：mrp+/ef-/sly+/gdh+/gapdh+/fbps-/orf2-，與實驗室以往分離的豬鏈球菌2型菌株具有一定的差異性，需要進一步的分析及今后的動物實驗以驗證毒力基因跟致病性的相關(guān)性。

本研究同時還對豬鏈球菌的7個管家基因(aroA-cpn60-dpr-gki-mutS-recA-thrA)進行分析，經(jīng)提交網(wǎng)站(http://pubmlst.org/ssuis/)分析得出該菌株的等位基因譜為8-30-5-45-44-22-109，序列分型為ST373型別。人感染豬鏈球菌血清型5型報道比較少，在泰國、瑞典、美國、日本曾有報道過，但此次分離菌株的MLST型別為ST373，與泰國分離ST181和日本ST752型別不一樣，非同一來源菌株[10-12]，且也不是我國分離株常見的ST7型或者ST1型，應(yīng)該引起我們今后工作中的重視。同時為了解該豬鏈球菌5型菌株的藥物敏感情況，通過體外藥敏實驗提示對氯霉素和四環(huán)素耐藥，對氨芐西林、氨芐青霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、利奈唑胺、萬古霉素、替加環(huán)素等藥物為敏感，與文獻報道的其他豬鏈球菌耐藥結(jié)果基本一致[13-16]。

綜上所述，福建省此次分離到的豬鏈球菌血清型5型，也提示了5型也可以引起人體感染，應(yīng)加以重視。雖然生化鑒定及質(zhì)譜分析均能鑒定到豬鏈球菌屬，但如需要進一步分析到血清型，可采取PCR方法對莢膜分型糖(CPS)進行血清型基因鑒定，并可測定相關(guān)的毒力基因判斷強弱毒株，同時由于MLST方法可以快速實現(xiàn)互聯(lián)網(wǎng)共享，可用于對豬鏈球菌5型的分子流行病學(xué)分析。

利益沖突：無