豬帶絳蟲Ts14-3-3.2重組蛋白誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的研究

劉美辰，歐陽任輝,2，羅 波，周必英

14-3-3蛋白是一種在真核生物中廣泛存在且高度保守的蛋白質(zhì)家族[1]，其蛋白二聚體可結(jié)合多種靶蛋白，通過讓2個(gè)靶蛋白相互靠近而產(chǎn)生作用，因此很多學(xué)者將其看作一種接頭蛋白或配體蛋白(adaptor proteins)[2]，從而參與了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分裂增殖、衰老凋亡、酶活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞骨架的塑造等多種重要的生命活動(dòng)[3]。

目前，很多學(xué)者以寄生蟲14-3-3蛋白作為一種候選疫苗分子進(jìn)行了廣泛的研究[4]。課題組前期已證實(shí)豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴中Ts14-3-3.2在基因[5]和蛋白(另文發(fā)表)水平上均有表達(dá)，并在成功制備了Ts14-3-3.2重組蛋白的基礎(chǔ)上(另文發(fā)表)，本研究將該重組蛋白免疫昆明小鼠，采用間接ELISA法檢測免疫小鼠血清特異性IgG及其亞類(IgG1、IgG2a)水平；通過CCK-8法檢測免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)；雙抗夾心ELISA法檢測免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平，進(jìn)一步觀察其誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平，旨在初步探究該重組蛋白的免疫原性，為進(jìn)一步用于抗囊尾蚴感染的免疫保護(hù)力研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1Ts14-3-3.2重組蛋白來源 課題組前期已通過pC2nl質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系成功制備了較高純度的Ts14-3-3.2重組蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量約為29 kDa，利用該重組蛋白制備的免抗Ts14-3-3.2多克隆抗體可與豬帶絳蟲成蟲及囊尾蚴中的天然Ts14-3-3.2蛋白發(fā)生反應(yīng)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只6～8周齡SPF級(jí)雌性昆明小鼠，購自重慶實(shí)崠生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001]。本實(shí)驗(yàn)已通過遵義醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心審查，符合動(dòng)物倫理要求。

1.1.3主要試劑儀器 小鼠脾淋巴細(xì)胞分離試劑盒(天津?yàn)笊镏破酚邢薰?；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；刀豆蛋白A(Concanavalin A, ConA)、弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant, CFA)、弗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant, IFA)(美國Sigma公司)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a(英國Abcam公司)；TMB顯色液、ELISA抗原包被稀釋液、HRP酶標(biāo)抗體稀釋液(北京索萊寶科技有限公司)；CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒(美國AXYGEN公司)；鼠IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10檢測試劑盒(北京誠林生物公司)；其它試劑均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；超凈工作臺(tái)(中國蘇凈集團(tuán))；酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

1.2 方 法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與免疫 將60只全雌性昆明小鼠隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為Ts14-3-3.2重組蛋白50 μg劑量組、100 μg劑量組、150 μg劑量組以及弗氏佐劑對(duì)照組和PBS對(duì)照組。Ts14-3-3.2重組蛋白各劑量組采用重組蛋白與等體積CFA充分乳化后進(jìn)行，間隔14 d后加強(qiáng)免疫1次，連續(xù)2次，加強(qiáng)免疫采用等體積IFA乳化，對(duì)照組分別注射相應(yīng)弗氏佐劑和PBS。均以多點(diǎn)皮下注射方式接種。

1.2.2小鼠血清標(biāo)本采集 在首次免疫后0 d、28 d、56 d每組各取4只小鼠，眼球摘除采血，分離血清，-20 ℃凍存待查。以Ts14-3-3.2重組蛋白(40 μg/mL)作為抗原包被酶標(biāo)板，每孔100 μL；以小鼠血清(1∶100稀釋)為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶10 000稀釋)、IgG1(1∶1 000稀釋)、IgG2a(1∶1 000稀釋)為二抗，采用間接ELISA法測定血清特異性IgG及IgG1、IgG2a水平。

1.2.3小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液制備 以無菌操作解剖取小鼠脾臟，按小鼠脾淋巴細(xì)胞分離試劑盒說明書制備脾淋巴細(xì)胞懸液，并使用10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至濃度為5×106/mL，備用。

1.2.4脾淋巴細(xì)胞增殖水平的測定 采用CCK-8法對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖水平進(jìn)行檢測。每份小鼠標(biāo)本均分設(shè)原液組、ConA刺激組、Ts14-3-3.2抗原刺激組，以1.2.3獲取的脾淋巴細(xì)胞懸液200 μL/孔加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(即：每孔加入了1×106個(gè)脾淋巴細(xì)胞)，將Ts14-3-3.2重組蛋白和ConA各取2 μg分別加入抗原刺激組和ConA刺激組，混勻，置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)46 h后，各組各孔分別加入CCK-8溶液20 μL，混勻，繼續(xù)置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的OD值(即OD450值)。

1.2.5脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平的測定 每份小鼠標(biāo)本均分設(shè)原液組、ConA刺激組、Ts14-3-3.2抗原刺激組，以1.2.3步驟獲取的脾淋巴細(xì)胞懸液0.5 mL/孔加至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將Ts14-3-3.2重組蛋白和ConA各取5 μg分別加入抗原刺激組和ConA刺激組，混勻，置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，將各組各孔培養(yǎng)液4 000 r/min離心，收集上清液，-20 ℃凍存待查。采用雙抗夾心ELISA法檢測上清液中IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10濃度。

2 結(jié) 果

2.1小鼠血清特異性IgG、IgG1、IgG2a水平 如表1～3所示，小鼠血清中特異性IgG、IgG1、IgG2a水平，Ts14-3-3.2重組蛋白各劑量組均在首次免疫后第28～56 d顯著升高且在56 d顯著高于28 d，以及同時(shí)段150 μg劑量組>100 μg劑量組>50 μg劑量組(IgG：F=3365.893,P<0.05；IgG1：F=7879.129,P<0.05；IgG2a：F=4273.769,P<0.05)；同時(shí)段佐劑組與PBS組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 Ts14-3-3.2重組蛋白免疫小鼠血清特異性IgG水平值)Tab.1 Level of specific IgG in sera in mice immunized with Ts14-3-3.2 recombinant protein

表2 Ts14-3-3.2重組蛋白免疫小鼠血清特異性IgG1水平值)Tab.2 Level of specific IgG1 in sera in mice immunized with Ts14-3-3.2 recombinant protein

表3 Ts14-3-3.2重組蛋白免疫小鼠血清特異性IgG2a水平值)Tab.3 Level of specific IgG2a in sera in mice immunized with Ts14-3-3.2 recombinant protein

2.2小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平 如表4所示，小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平，Ts14-3-3.2重組蛋白各劑量組經(jīng)抗原及ConA刺激，均在首次免疫后28～56 d升高，抗原刺激組免疫后28 d達(dá)到峰值，ConA刺激組58 d仍顯著高于28 d，同時(shí)段150 μg劑量組>100 μg劑量組>50 μg劑量組，以及同時(shí)段同組內(nèi)，ConA刺激組>抗原刺激組>空白原液組(F=339.571，P<0.05)；佐劑組與PBS組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 Ts14-3-3.2重組蛋白免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平值)Tab.4 Level of spleen lymphocyte proliferation in mice immunized with Ts14-3-3.2 recombinant protein

2.3小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10水平 如表5～8所示，小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10水平，Ts14-3-3.2重組蛋白各劑量組均在首次免疫后28～56 d升高，免疫后第28 d達(dá)到峰值，同時(shí)段150 μg劑量組>100 μg劑量組>50 μg劑量組；以及同時(shí)段同組內(nèi)，ConA刺激組>抗原刺激組>空白原液組(IL-2：F=253.527,P<0.05；IFN-γ：F=351.819,P<0.05；IL-4：F=103.935,P<0.05；IL-10：F=233.754,P<0.05)；佐劑組與PBS組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表5 Ts14-3-3.2重組蛋白免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-2水平值)Tab.5 Level of IL-2 in spleen lymphocyte culture supernatant in mice immunized with Ts14-3-3.2 recombinant protein

表6 Ts14-3-3.2重組蛋白免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IFN-γ水平值)Tab.6 Level of IFN-γ in spleen lymphocyte culture supernatant inmice immunized with Ts14-3-3.2 recombinant protein

表7 Ts14-3-3.2重組蛋白免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-4水平值)Tab.7 The level of IL-4 in spleen lymphocyte culture supernatant in mice immunized with Ts14-3-3.2 recombinant protein

表8 Ts14-3-3.2重組蛋白免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-10水平值)Tab.8 Level of IL-10 in spleen lymphocyte culture supernatant in mice immunized with Ts14-3-3.2 recombinant protein

3 討 論

囊蟲病是一種對(duì)人體健康危害極大的人獸共患寄生蟲病，囊尾蚴的寄生可引起不同部位發(fā)生病變，其中以腦囊蟲病最為嚴(yán)重，存在較高的致殘率、致死率，并且由于囊蟲病臨床癥狀復(fù)雜多樣，易與其它顱內(nèi)疾病混淆而誤診誤治。該病呈全球性分布，在我國西南地區(qū)和一些少數(shù)民族地區(qū)由于醫(yī)療衛(wèi)生水平相對(duì)較低、飲食習(xí)慣不良，囊蟲病仍然有散在病例[6-8]。研究表明，囊蟲病的發(fā)生不僅有體液免疫應(yīng)答的參與，也有細(xì)胞免疫應(yīng)答的參與[9-10]。

IgG是血清主要的抗體成分，由脾、淋巴結(jié)等部位的漿細(xì)胞合成分泌，以單體形式存在，可分為IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4等亞型，Th1型細(xì)胞因子促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG2a抗體亞型，Th2則促進(jìn)IgG1和IgE的產(chǎn)生，因此IgG1和IgG2a水平也可提示免疫應(yīng)答的類型和強(qiáng)弱[11-13]。本研究通過測定免疫小鼠血清IgG1和IgG2a水平，兩者比例平衡，提示為Th1/Th2混合型免疫應(yīng)答，與雷娜等[14]、曾瑞紅等[15]的研究類似，在寄生蟲14-3-3重組蛋白研究領(lǐng)域，華支睪吸蟲[28]、日本血吸蟲[16]和旋毛蟲[17]14-3-3重組蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG1和IgG2a，與本研究相仿，而細(xì)粒棘球絳蟲14-3-3重組蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體傾向于IgG2a[18]。此外，本研究中三種抗體水平在一定范圍內(nèi)均呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，與劉慶中等[16]、鄭姣等[19]的結(jié)果類似。

淋巴細(xì)胞增殖是免疫系統(tǒng)接觸抗原后，淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖分化以發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)，其增殖水平反映了淋巴細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而反映了機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答能力，常用于評(píng)價(jià)淋巴細(xì)胞的活性，而ConA作為一種絲裂原，可非特異性地刺激T淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖[20-23]。目前最常用的淋巴細(xì)胞增殖測定方法包括四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法和CCK-8法，兩者均快速簡便、靈敏度高，無放射性污染，特別適合大批量檢測，尤其在檢測懸浮細(xì)胞增殖中具有優(yōu)勢，其中MTT法相對(duì)CCK-8法操作仍顯繁瑣，往往因甲臜顆粒溶解不全影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，靈敏度也不及后者[24]，因此有學(xué)者認(rèn)為CCK-8法優(yōu)于MTT法[20,25]。由于小鼠淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)影響因素較多，有學(xué)者認(rèn)為采用5×106/mL的脾細(xì)胞濃度、2～10 μg/mL的ConA刺激濃度可能是該實(shí)驗(yàn)的最佳條件[21]。本研究采用CCK-8法，5×106/mL脾細(xì)胞濃度，陽性對(duì)照采用10 μg/mL ConA刺激，對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平進(jìn)行測定，結(jié)果顯示不同劑量Ts14-3-3.2重組蛋白免疫昆明小鼠后，體外抗原刺激脾淋巴細(xì)胞出現(xiàn)明顯增殖，與王強(qiáng)等[26]結(jié)論類似，其增殖水平均于28～56 d升高并于28 d達(dá)到峰值，高劑量組明顯高于低劑量組，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。

根據(jù)原始CD4+T細(xì)胞受抗原信號(hào)刺激分化后產(chǎn)生細(xì)胞因子，可分為Th1與Th2兩種細(xì)胞亞群[27]。其中，Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TGF-β等，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答[28]，這兩種細(xì)胞亞群之間存在動(dòng)態(tài)平衡及相互抑制[29-31]。其中Th1應(yīng)答有利于機(jī)體清除感染原，但容易引發(fā)宿主自身損害；Th2應(yīng)答參與抗寄生蟲的保護(hù)性免疫，但也可能引起感染的慢性化[32]，Th1型免疫應(yīng)答所誘導(dǎo)的抗寄生蟲免疫保護(hù)力顯著高于Th2型[33-35]。通過測定T細(xì)胞所產(chǎn)生細(xì)胞因子的類型和水平，可以明確免疫反應(yīng)的類型和強(qiáng)弱[36]。對(duì)囊蟲病而言，Th1和Th2應(yīng)答同樣在其發(fā)生、發(fā)展過程中同樣起著非常重要的作用[9]。本研究通過Ts14-3-3.2重組蛋白聯(lián)合弗氏佐劑免疫小鼠，測定培養(yǎng)脾淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的Th1型細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ)和Th2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)，觀察到Ts14-3-3.2重組蛋白可誘導(dǎo)Th1/Th2混合型免疫應(yīng)答，與抗體測定結(jié)論相符，這與既往研究發(fā)現(xiàn)的重組蛋白常可刺激機(jī)體產(chǎn)生Th1/Th2混合型應(yīng)答[14-15, 37]結(jié)論相一致，但某些重組蛋白誘導(dǎo)Th2型為主[38]，也有免疫初期Th1型，后期轉(zhuǎn)為Th2型為主的報(bào)道[39]。在寄生蟲14-3-3重組蛋白免疫效應(yīng)的一系列研究中，通過細(xì)胞因子測定發(fā)現(xiàn)旋毛蟲14-3-3重組蛋白可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1/Th2混合型應(yīng)答[17]，與本研究類似，而細(xì)粒棘球絳蟲14-3-3重組蛋白則誘導(dǎo)Th1型主導(dǎo)的免疫應(yīng)答[18]，可能與不同蟲種蛋白差異有關(guān)。某些添加物(如佐劑[40])還可調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答使之以Th1型為主[41-43]，因此通過免疫調(diào)節(jié)劑增強(qiáng)免疫效果也是研究方向之一。

本研究通過對(duì)比小鼠免疫前后的血清中特異性抗體及其亞型水平變化，并檢測重組蛋白體外刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平，初步明確了Ts14-3-3.2重組蛋白誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答變化趨勢。結(jié)果表明，Ts14-3-3.2重組蛋白在28～56 d均誘導(dǎo)Th1/Th2混合型免疫應(yīng)答，而免疫系統(tǒng)發(fā)揮的效應(yīng)是體液免疫和細(xì)胞免疫綜合作用的結(jié)果，提示Ts14-3-3.2重組蛋白具有囊蟲病疫苗潛力。此外，細(xì)胞因子水平56 d均低于28 d，可能與免疫程序終止無進(jìn)一步抗原刺激有關(guān)；抗體水平56 d高于28 d，可能與加強(qiáng)免疫誘導(dǎo)的再次應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體濃度高、體內(nèi)持續(xù)時(shí)間長有關(guān)；免疫的最適劑量仍需要通過進(jìn)一步增加抗原劑量才能明確。

此外，本研究觀察到原液組、各劑量抗原組、ConA組脾淋巴細(xì)胞增殖水平和細(xì)胞因子水平均表現(xiàn)為ConA刺激>抗原刺激>原液，表明ConA的非特異性刺激誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌水平高于抗原的特異性刺激，可能與抗原僅能特異性誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌有關(guān)。

本文研究了以不同劑量Ts14-3-3.2重組蛋白，在不同時(shí)間誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫效果。結(jié)果表明該重組蛋白可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，初步確定了較為合適的免疫劑量，為下一步進(jìn)行該蛋白誘導(dǎo)的免疫保護(hù)力研究奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突：無