多房棘球蚴亮氨酸氨基肽酶優(yōu)勢(shì)抗原表位的鑒定

王 蕾,魏 威,周 培,劉海生,楊寶良,李潤(rùn)樂(lè),湯 鋒

棘球蚴病是一種歷史悠久的人獸共患病，關(guān)于該病最早記錄可追溯至公元前5世紀(jì)，《Hippocratic Oath》一書中首次提到[1]。棘球蚴病的流行地區(qū)分布廣泛[2]，2012年WHO已將棘球蚴病列為到2050年必須控制或消滅的17種被忽視疾病之一[3]。由多房棘球絳蟲的蚴蟲感染人體引起的多房棘球蚴病最為嚴(yán)重，因其在肝臟內(nèi)是浸潤(rùn)、侵襲性生長(zhǎng)，與腫瘤生長(zhǎng)方式類似；據(jù)調(diào)查，多房棘球蚴病在人獸共患寄生蟲病中高居第2位[4]。在我國(guó)，多房棘球蚴病主要分布于西部畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的地區(qū)[5]，目前該病多采用藥物和手術(shù)聯(lián)合治療，但因?yàn)楦甙褐委熧M(fèi)用，藥物較大的副作用以及手術(shù)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)病人的生存質(zhì)量產(chǎn)生了嚴(yán)重的消極影響[3]。目前疫苗是預(yù)防和控制傳染病的有效措施之一,多房棘球蚴病防控的長(zhǎng)期性和復(fù)雜性決定了該病應(yīng)采用易行、經(jīng)濟(jì)和有效的防控方法。

表位疫苗因其可以刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答，同時(shí)兼具較好的安全性、效率較高、交叉反應(yīng)少等特點(diǎn)，成為近些年來(lái)發(fā)展迅速的疫苗之一[6]。表位疫苗在抗細(xì)菌與病毒感染[7-8]、抗腫瘤[9]、抗免疫系統(tǒng)疾病[10]和抗寄生蟲疾病[11]等領(lǐng)域擁有廣泛的應(yīng)用前景。研制表位疫苗的關(guān)鍵是要找到優(yōu)勢(shì)抗原表位，亮氨酸氨基肽酶是一種金屬肽酶，M17氨基肽酶家族(M17-LAP)利用高度保守的六聚體結(jié)構(gòu)和雙核金屬中心選擇性地從多肽中裂解N端氨基酸[12]。亮氨酸氨基肽酶在微生物、哺乳動(dòng)物和植物中廣泛存在并具有特定的作用[13]，M17-LAP被證實(shí)它在許多寄生蟲感染中起到了保護(hù)宿主的作用。重組LAP蛋白與不同種類的商業(yè)化佐劑(鋁、明礬和弗氏佐劑)混合免疫，對(duì)抗綿羊肝片吸蟲感染達(dá)到較高水平的保護(hù)率[14]。研究人員進(jìn)行了豬帶絳蟲LAP基因的克隆與鑒定，為研究豬帶絳蟲在終末宿主中的生長(zhǎng)、發(fā)育機(jī)制提供新的見解，LAP可能成為藥物治療或疫苗研制的有效靶點(diǎn)[15]。Maodi Wu等[16]通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)方法鑒定細(xì)粒棘球蚴LAP的組織分布，分析了LAP疫苗研究的潛在價(jià)值。因此，LAP在多房棘球蚴感染中是否具有保護(hù)作用、能否成為表位疫苗的一個(gè)有效抗原值得研究。本實(shí)驗(yàn)主要根據(jù)課題組前期使用IEDB、Syfpeithi、Bcepred、ABCpred等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)的T、B細(xì)胞抗原表位結(jié)果[17]，進(jìn)一步鑒定具有良好效果的表位。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑 pCzn1-LAP質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；IPTG(Biotopped公司)；蛋白純化Ni-NTA Resin柱(GenScript公司)；弗氏佐劑(Sigma公司)；小鼠淋巴細(xì)胞分離液(Cedarlane公司)；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基(HyClone公司)；MTS溶液(Promega公司)Anti-Mouse CD4 PE-Cyanine7抗體、Anti-Mouse IFN-γ FITC抗體、Anti-Mouse IL-4 APC抗體(Bio-gems公司)；ELISA pot IL-4和IFN-γ試劑盒(Mabtech公司)；HRP conjugated goat anti-mouse IgG (Abcam公司)；LAP抗原表位小肽通過(guò)上海昕浩生物公司合成。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 北京Spaefer公司購(gòu)入的6～8周大小的雄性BALB/c小鼠，許可證號(hào)為SCXK9(京)2019-0010，飼養(yǎng)在SPF級(jí)環(huán)境下。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1蛋白質(zhì)原核表達(dá) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)方法如文獻(xiàn)[18]所述，將上述獲得200 μL 的LAP甘油菌液加到100 mL的含有Ampicillin 的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃，搖床180 r/min培養(yǎng)10 h[19]。將種子液5 mL接種到500 mL的含有Ampicillin LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min培養(yǎng)4 h后加入IPTG(0.5 mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h[20]。菌液培養(yǎng)完成后的沉淀用1×的PBS混懸，進(jìn)行超聲破碎，再用8 mol/L尿素重復(fù)進(jìn)行超聲破碎。將經(jīng)過(guò)上述操作后LAP菌液上清加到34 mm的透析袋中進(jìn)行復(fù)性步驟，使用高親和Ni-NTA Resin 提純LAP蛋白，最后進(jìn)行蛋白電泳分析[20]。

1.3.2動(dòng)物免疫 將小鼠分成LAP實(shí)驗(yàn)組和PBS對(duì)照組，每組6只。將純化后的LAP蛋白(50 μg/只)或無(wú)菌PBS和弗氏佐劑等比進(jìn)行抗原乳化，呈“油包水”的狀態(tài)。小鼠腹腔免疫方案如文獻(xiàn)[21]所述，共4次，每次間隔7 d。

1.3.3MTS法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖 在小鼠脾臟淋巴細(xì)胞研磨液中加入淋巴細(xì)胞分離液(1∶3)，1 000 g離心15 min，吸取白色細(xì)胞層，用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后使用[22]。在細(xì)胞培養(yǎng)板中加入LAP各抗原小肽(10 μg/mL)和淋巴細(xì)胞使(2.5×106個(gè)/mL)總體積為200 μL，陰性對(duì)照使用的是PBS，培養(yǎng)箱中孵育60 h。脾臟淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)用MTS溶液(20 μL/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后測(cè)OD490nm處的吸光值。刺激指數(shù)=實(shí)驗(yàn)組OD值/陰性對(duì)照組OD值。

1.3.4細(xì)胞因子ELISA pot檢測(cè)T細(xì)胞表位 用無(wú)菌PBS(200 μL/孔)洗滌4次ELISA pot板子(IL-4、IFN-γ)，然后在室溫下用含10%的胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基封閉2 h[23]，無(wú)菌PBS(200 μL/孔)洗滌3次。在ELISA pot反應(yīng)板中每孔加入5×105個(gè)/mL淋巴細(xì)胞和LAP各抗原小肽(10 μg/mL)使總體積為200 μL，陰性對(duì)照為PBS。用鋁箔將板子包裹放在恒溫培養(yǎng)箱中孵育48 h(37 ℃，5%CO2)[24]，根據(jù)說(shuō)明書依次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。最后用斑點(diǎn)計(jì)數(shù)軟件分析結(jié)果，F(xiàn)ast Shot自動(dòng)拍攝軟件進(jìn)行圖像定位與校正。

1.3.5細(xì)胞因子流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞表位 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方案如文獻(xiàn)[21]所述，在細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入5×105個(gè)/mL淋巴細(xì)胞，同時(shí)加入LAP各抗原小肽(20 μg/mL)使總體積為1 mL，在溫度為37 ℃，含有5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中孵育10 h。培養(yǎng)結(jié)束前6 h每孔分別加入布雷菲德菌素A和莫能霉素各1 μL。加入Anti-Mouse CD4 PE-Cyanine7抗體(0.2 mg/mL)，室溫孵育0.5 h，加入1 mL的破膜固定液室溫避光孵育2 h。用2 mL的1×Permeabilization緩沖液洗滌淋巴細(xì)胞，加入Anti-Mouse IFN-γ FITC(0.2 mg/mL)、Anti-Mouse IL-4 APC(0.5 mg/mL)抗體室溫避光孵育1 h后，用2 mL緩沖液重復(fù)洗滌，適量PBS混懸淋巴細(xì)胞用于機(jī)器檢測(cè)。

1.3.6抗原表位特異性ELISA鑒定B細(xì)胞表位 抗原表位特異性ELISA檢測(cè)方法如文獻(xiàn)[24]所述，在ELISA96孔板中加入各LAP抗原小肽(10 μg/mL)100 μL，4 ℃包被過(guò)夜。陽(yáng)性對(duì)照為L(zhǎng)AP總蛋白，陰性對(duì)照用PBS。含3% Albumin Bovine V的PBST封閉板子1 h。抗LAP或PBS的小鼠血清(1∶3 000)37 ℃孵育1 h。HRP conjugated goat anti-mouse IgG(1∶10 000)37 ℃孵育1 h。

1.3.7蛋白質(zhì)同源建模 LAP氨基酸序列從NC-BI-GenBank(CDS36608.1)獲取，然后將獲取的氨基酸序列上傳到SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模[25]，并通過(guò)PyMOL軟件(2.5.0版)對(duì)鑒定出的抗原表位分布在LAP蛋白上準(zhǔn)確定位[26]。

1.3.8統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)描述，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(SPSS 19.0)。P值<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1蛋白質(zhì)原核表達(dá)與純化 LAP蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)成功建立，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)后，菌液表達(dá)產(chǎn)量大幅增加。通過(guò)蛋白復(fù)性以及Ni-NTA Resin親和層析得到一個(gè)大小約為57 kDa的LAP蛋白(圖1)。

圖1 LAP蛋白純化結(jié)果圖Fig.1 Purified LAP protein

2.2小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖 各抗原小肽刺激LAP免疫過(guò)后的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖反應(yīng)，其結(jié)果如圖2所示。與PBS對(duì)照組相比較，LAP實(shí)驗(yàn)組結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明LAP各抗原小肽具備良好的抗原性。其中LAP蛋白刺激指數(shù)(2.934±0.096vs1.160±0.019，P=0.000)數(shù)值最高，抗原小肽LAP106-120(1.626±0.357vs1.116±0.078，P=0.007)、LAP79-93(1.580±0.319vs0.982±0.186，P=0.003)和LAP504-518(1.552±0.199vs0.938±0.091，P=0.000)刺激指數(shù)數(shù)值較其他小肽高。根據(jù)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取優(yōu)勢(shì)表位小肽為L(zhǎng)AP106-120、LAP79-93和LAP504-518。

2.3ELISA pot篩選T細(xì)胞表位結(jié)果 各LAP抗原小肽分別與LAP和PBS組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞共刺激培養(yǎng)，IFN-γ和IL-4的ELISA pot實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別代表Th1與Th2優(yōu)勢(shì)表位(圖3)。與PBS對(duì)照組比較，LAP實(shí)驗(yàn)組兩種細(xì)胞因子分泌量均較高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中LAP396-410(52.000±11.832vs19.000±0.894，P=0.001)、LAP504-518(50.667±4.501vs20.000±1.095，P=0.000)和LAP106-120(49.667±11.552vs22±3.286，P=0.001)分泌IFN-γ斑點(diǎn)計(jì)數(shù)值較高；LAP504-518(45.333±6.470vs15.333±2.733，P=0.000)、LAP313-328(34.333±3.141vs14.000±2.366，P=0.000)和LAP396-410(28.667±5.240vs15.333±1.861，P=0.001)分泌IL-4斑點(diǎn)計(jì)數(shù)值較高。綜上所述，ELISA pot鑒定的Th1型優(yōu)勢(shì)抗原表位為L(zhǎng)AP396-410、LAP504-518和LAP106-120；Th2型優(yōu)勢(shì)抗原表位為L(zhǎng)AP504-518、LAP313-328和LAP396-410。

**P<0.01；***P<0.001圖2 淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)Fig.2 Proliferation of lymphocytes from mice immunized with LAP or PBS

*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.01A： IFN-γ斑點(diǎn)數(shù); B: IL-4斑點(diǎn)數(shù); C: IFN-γ分泌前三的小肽; D: IL-4分泌前三的小肽圖3 細(xì)胞因子ELISA pot檢測(cè)Fig.3 ELISA pot test of cytokines of mouse spleen lymphocytes

2.4流式細(xì)胞術(shù)篩選T細(xì)胞表位結(jié)果 各LAP抗原小肽分別與小鼠脾臟淋巴細(xì)胞共刺激培養(yǎng)，細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4分泌的流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別代表Th1與Th2優(yōu)勢(shì)表位。與PBS組相比較，LAP組脾臟淋巴細(xì)胞經(jīng)過(guò)抗原小肽刺激后，細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4陽(yáng)性率百分比大部分結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4、圖5)。其中LAP79-93(1.100±0.210vs0.300±0.190，P=0.000)、LAP396-410(0.900±0.179vs0.300±0.179，P=0.000)和LAP106-120(0.800±0.179vs0.283±0.147，P=0.000)分泌IFN-γ陽(yáng)性率百分比較高；LAP13-28(1.233±0.339vs0.300±0.210，P=0.000)、LAP495-510(0.933±0.042vs0.367±0.216，P=0.001)和LAP396-410(0.900±0.155vs0.267±0.225，P=0.000)分泌IL-4陽(yáng)性率百分比較高。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，流式細(xì)胞術(shù)鑒定的Th1型優(yōu)勢(shì)抗原表位為L(zhǎng)AP79-63、LAP396-410和LAP106-120；Th2型優(yōu)勢(shì)抗原表位為L(zhǎng)AP13-28、LAP495-510和LAP396-410。

*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001A: IFN-γ分泌前三的小肽; B: LAP所有小肽的IFN-γ分泌圖4 流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+T細(xì)胞IFN-γ的含量Fig.4 Analysis of IFN-γ in CD4+T cells by flow cytometry

*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001A: IL-4分泌前三的抗原小肽; B: LAP所有小肽IL-4分泌圖5 流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+T細(xì)胞IL-4的含量Fig.5 Analysis of IL-4 in CD4+T cells by flow cytometry

2.5抗原表位特異性ELISA鑒定B細(xì)胞表位結(jié)果 各抗原小肽分別與小鼠血清反應(yīng)，與對(duì)照組相比，LAP實(shí)驗(yàn)組的小鼠血清ELISA結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中LAP464-479(0.932±0.148vs0.135±0.020，P=0.000)、LAP495-510(0.894±0.203vs0.142±0.056，P=0.000)和LAP313-328(0.885±0.141vs0.185±0.032，P=0.000)血清IgG值較高。所以，小鼠血清抗原表位特異性ELISA鑒定的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位為L(zhǎng)AP464-479、LAP495-510和LAP313-328(圖6)。

*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001圖6 LAP抗原小肽與血清 ELISA 檢測(cè)Fig.6 ELISA of antigen peptides with serum

2.6LAP蛋白3D結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建 根據(jù)氨基酸序列對(duì)LAP蛋白進(jìn)行同源建模及抗原小肽定位，結(jié)合預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行分析。同源建模選取的模板為E.coliAminopeptidase A (SMTL ID: 1gyt.1)，建模3D結(jié)果如圖7A所示為同源六聚體結(jié)構(gòu)。PyMOL軟件對(duì)鑒定出優(yōu)勢(shì)抗原表位在LAP蛋白中的具體分布情況進(jìn)行了可視化定位分析，結(jié)果如圖7B所示，位于蛋白表面的抗原表位占大部分。

3 討 論

機(jī)體接受抗原的刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，而表位是使得抗原發(fā)揮效力最基本的單位[27]，優(yōu)勢(shì)抗原表位的鑒定是表位疫苗能否研制成功的重要因素之一。抗原表位可由氨基酸殘基組成，也可由多糖殘基或核苷酸組成[28]。根據(jù) T細(xì)胞和B 細(xì)胞所識(shí)別的抗原表位的不同，可分為T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位[29]。抗原表位鑒定的常用方法包括生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、多肽合成技術(shù)、X-ray衍射技術(shù)、噬菌體展示肽和質(zhì)譜技術(shù)等[30]，或者多種技術(shù)聯(lián)合來(lái)提高鑒定表位的正確率。近兩年興起的新方法包括全基因組的高通量平臺(tái)T-Scan，基于TCR表位掃描方法來(lái)全面系統(tǒng)識(shí)別有效的抗原[31]。本實(shí)驗(yàn)T細(xì)胞表位鑒定方法包括：淋巴細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)，ELISA pot；B細(xì)胞表位鑒定方法主要是動(dòng)物血清抗原表位特異性ELISA。這種首先通過(guò)信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)潛在的優(yōu)勢(shì)表位，再結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證表位的聯(lián)合方法更具有安全性。

CD4+T細(xì)胞，也被稱為輔助性T細(xì)胞，是介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的效應(yīng)分子。1986年，研究人員在小鼠體內(nèi)證明了CD4+T細(xì)胞根據(jù)其產(chǎn)生的細(xì)胞因子可分為2個(gè)功能不同的亞群(Th1和Th2)[32-33]。Th1型CD4+T細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子IFN-γ，激活巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞(產(chǎn)生IgG)對(duì)抗胞內(nèi)感染; Th2型CD4+T細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生IL-4，激活肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞以清除體內(nèi)寄生蟲感染[34]。在多房棘球蚴感染過(guò)程中，機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答特征是Th1和Th2混合型[3]，所以本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)IFN-γ和IL-4來(lái)鑒定Th1和Th2的優(yōu)勢(shì)表位。與電子顯微鏡或光鏡相比，T細(xì)胞主要通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)CD分子來(lái)標(biāo)記。流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)對(duì)T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子定量分析，以及CD4陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)定量，可以反映細(xì)胞的狀態(tài)[35]。不同LAP抗原小肽刺激淋巴細(xì)胞，再熒光標(biāo)記CD4+T細(xì)胞，最后檢測(cè)胞內(nèi)Th1和Th2型細(xì)胞因子的陽(yáng)性率來(lái)篩選表現(xiàn)較好的抗原小肽。ELISA pot是單細(xì)胞水平分泌蛋白頻率的定量檢測(cè)，它被廣泛應(yīng)用于免疫反應(yīng)和疫苗效價(jià)的研究，如檢測(cè)分泌細(xì)胞因子的總量[36]。與PBS對(duì)照組相比較，LAP組IFN-γ和IL-4分泌的斑點(diǎn)數(shù)目較多。傳統(tǒng)的淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)方法主要是3H-TdR放射性核素標(biāo)記法，因其對(duì)環(huán)境的污染，目前已改用噻唑藍(lán)比色法，該方法具有靈敏度高，經(jīng)濟(jì)實(shí)用的特點(diǎn)[37]。本實(shí)驗(yàn)采用的MTS法是噻唑藍(lán)的優(yōu)化產(chǎn)品，簡(jiǎn)化了操作流程和節(jié)省了時(shí)間。經(jīng)過(guò)檢測(cè)各LAP抗原小肽均能刺激淋巴細(xì)胞的增殖發(fā)生。

A: LAP蛋白的3D結(jié)構(gòu)模型; B: 鑒定完成LAP優(yōu)勢(shì)表位的分布圖7 LAP蛋白結(jié)構(gòu)同源建模分析Fig.7 LAP protein structural mapping model

B細(xì)胞表位根據(jù)氨基酸的空間結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可以分成順序表位(線性表位)和構(gòu)象表位，其中約90%是構(gòu)象表位[38]。線性B細(xì)胞表位由肽段組成，可比較容易地代替抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)[39]。因此，線性B細(xì)胞表位雖然占比較少，卻受到了極大的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)利用人工合成的LAP小肽作為抗原，通過(guò)間接ELISA法來(lái)分析肽段與抗體之間反應(yīng)結(jié)果，鑒定出了優(yōu)勢(shì)的線性B細(xì)胞表位。根據(jù)SWISS-MODEL軟件所呈現(xiàn)出的多房棘球蚴LAP蛋白同源建模結(jié)果(圖7)，篩選出的表位分布于蛋白的表面居多，利于與抗體直接接觸，從而更容易讓機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。

據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)2008年至2018年間，我國(guó)因多房棘球蚴病住院的患者平均花費(fèi)4萬(wàn)元左右，呈逐年遞增趨勢(shì)，導(dǎo)致了較重的家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[40]。如果能成功研制出針對(duì)多房棘球蚴感染的表位疫苗，將從源頭切斷該病的傳播鏈，有益于畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的廣大地區(qū)包蟲病患者的身體健康，減輕他們的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。下一步實(shí)驗(yàn)我們計(jì)劃將鑒定的LAP優(yōu)勢(shì)抗原表位和EMY162、TSP3、SRf1蛋白的優(yōu)勢(shì)表位聯(lián)合設(shè)計(jì)一個(gè)4價(jià)多表位抗原肽，將其插入課題組自主研發(fā)的口服靶向M細(xì)胞的乳酸乳球菌表面展示投遞系統(tǒng)以構(gòu)建多房棘球蚴口服疫苗，探究該疫苗對(duì)小鼠、犬多房棘球蚴感染動(dòng)物模型的免疫保護(hù)作用。

利益沖突：無(wú)