水冬瓜葉的生藥學及其近紅外快速鑒別技術研究?

韓忠耀 王傳明 宋 偉 劉承貴

（黔南民族醫學高等專科學校，貴州 都勻 558000）

水冬瓜葉來源于山茱萸科植物有齒鞘柄木[Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia (Harms) Hu]的干燥葉，水冬瓜葉與水冬瓜根皮為山茱萸科植物有齒鞘柄木不同用藥部位[1]，其植物體屬于落葉小喬木。該藥在貴州省分布較廣，且野生藥材資源豐富，在貴州省內的黔南、畢節、遵義、貴陽等地均產。

近年來，有關落葉小喬木山茱萸科植物有齒鞘柄木的研究，主要集中在其藥用部位水冬瓜根皮的化學成分[2-5]、高效液相色譜指紋圖譜研究[6-7]、藥理作用[8-9]、工藝優化[10]、含量測定[11-12]、近紅外快速檢測[13]、病蟲害種類及野生資源破壞情況調查[14]、質量標準提升研究[15]等方面。近紅外光譜技術是近年來發展迅速且應用范圍較廣的新技術，檢測時主要利用近紅外光譜區與被檢測物質有機分子中含氫基團（O—H、N—H、C—H）振動的合頻和各級倍頻的吸收區一致，通過掃描樣品的近紅外光譜，以得到樣品中有機分子含氫基團的特征信息。由于其快速、綠色無污染、不破壞樣品、高效等優點[16-18]，在林產工業[19]、中藥材快速真偽鑒別與含量測定[20-21]、食品無損檢測及摻雜[22-24]等均有廣泛應用。徐燃等[25]針對湖北產山茱萸科植物有齒鞘柄木的藥用部位根皮（大接骨丹）開展了生藥學鑒定研究，而有關落葉小喬木水冬瓜葉的生藥學研究及近紅外光譜（NIR）快速真偽鑒別研究尚未見報道。

本研究以水冬瓜葉為研究對象，從性狀、表皮細胞及顯微鑒別特征對其進行研究，并利用近紅外光譜法建立水冬瓜葉藥材主成分分析（PCA）快速真偽定性鑒別模型，以期為更好地開發利用民族藥落葉小喬木水冬瓜葉藥材資源提供參考與依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用水冬瓜葉、根皮及樹皮藥材為自采，采集地點為貴州省都勻杉木湖溝渠、長順縣、惠水縣等地，經鑒定為山茱萸科植物有齒鞘柄木的葉、根皮與樹皮。其中水冬瓜葉藥材采集共48 批次（編號Y1～Y48），水冬瓜樹皮（編號S1～S6）、根皮（編號G1～G6）分別采集6 批次。Y1～Y42 用于近紅外建模，G1～G6 和S1～S6作為偽品驗證用，Y43～Y48 作為正品驗證用。樣品采集信息見表1。

表1 藥材采集信息表Tab.1 Information of collected medicinal materials

試劑：水合氯醛（武漢博萊特化工有限公司）、稀甘油（山東磊林商貿有限公司）、甲醇（天津科密歐化學試劑有限公司）等，以上試劑均為分析純。

1.2 設備

試驗主要設備與儀器：OLYMPUS CX31 光學顯微鏡成像顯微系統，奧林巴斯有限公司；烘箱，型號：101-3AB型，天津市泰斯特儀器有限公司；高速粉碎機，型號：WK-1000A，濰坊市北方制藥設備制造有限公司；藥典篩，紹興市上虞張興紗篩廠；Luminar 5030型AOTF-NIR近紅外光譜儀，主要部件包括光學部分、控制部分、電源適配器，軟件包括SNAP!光譜處理軟件，美國Brimrose公司；The Unscrambler化學計量學分析軟件，挪威CAMO公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 性狀鑒別

對水冬瓜葉新鮮植物體與干燥藥材進行觀察研究，描述其性狀特征。

1.3.2 顯微鑒別

1) 表面制片法。采用“表面撕離法”，用鑷子將新鮮水冬瓜葉的表皮輕輕撕下，將面朝上，置于載玻片上，滴加水合氯醛適量，蓋上蓋玻片，觀察水合氯醛水裝片組織學特征。

2) 粉末顯微特征鑒別。 將陰干后的藥材用粉碎機打成粉末，過65 目篩[篩孔平均內徑(250±9.9）μm]。按照《中華人民共和國藥典》（2015 年版四部）“2001顯微鑒別法”[26]制片，觀察水冬瓜葉粉末顯微特征并拍照。

1.3.3 近紅外快速鑒別

將55 ℃烘干后的藥材用粉碎機打成粉末，過65 目篩。以漫反射法采集水冬瓜葉藥材（編號Y1～Y48）、6 批次水冬瓜根皮藥材（編號G1～G6）與6 批次水冬瓜樹皮藥材（編號S1～S6）近紅外光譜（NIR）[13]。其中，Y1～Y42 作為建模用校正集，通過NIR軟件將G1～G6（用于偽品驗證）、S1～S6（用于偽品驗證）與Y43～Y48（用于正品驗證）合并后作為驗證集，分別采用一階導數（First derivative，1D）+Savitzky-golay平滑處理等方法對原始光譜進行預處理。隨后，將水冬瓜葉藥材42 批次預處理后的NIR導入The Unscrambler化學計量學分析軟件，建立PCA快速真偽定性鑒別模型。模型建立后，將驗證集導入The Unscrambler化學計量學分析軟件，導入建立的NIR-PCA模型，進行模型驗證與真偽鑒別。

2 結果與分析

2.1 性狀鑒定結果

2.1.1 野生水冬瓜葉植物形態觀察

分別從成熟水冬瓜葉的葉長、葉寬、葉柄長、葉中脈顏色、來源等，對野生水冬瓜葉植物形態進行鑒定，結果見表2。野生水冬瓜葉植物體呈近于闊心形[27]，草綠至深綠色，葉互生，紙質，通常有5枚裂片，葉邊緣有稀疏鋸齒；葉柄較長，基部呈鞘狀，見圖1。

表2 野生水冬瓜葉植物形態測量指標結果（n=6）Tab.2 Morphological measurement indexes of wildToricellia Angulata Oliv.var.intermedia (Harms) Hu leaves (n=6)

圖1 野生水冬瓜葉植物體形態圖Fig.1 Picture of wild Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia (Harms) Hu leaves

2.1.2 干燥葉性狀鑒定結果

圖2 落葉小喬木水冬瓜葉藥材性狀圖Fig.2 Picture of Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia (Harms) Hu leaves for medicinal materials

水冬瓜葉藥材見圖2。藥材多皺縮，邊緣卷曲。完整葉片展開后近于闊心形，長11.8～28.2 cm，寬14.5～36.2 cm；草綠色或黑綠色或棕黑色，先端漸尖，邊緣有疏鋸齒；葉脈淺白色～紅紫色。葉柄長7.4～25.6 cm，葉柄紅紫色或棕褐色。質脆易碎。氣微，味淡澀、微苦。一般以葉片完整、色澤草綠或深綠者為佳。

2.2 顯微鑒別結果

2.2.1 葉表皮

圖3 為水冬瓜葉表皮細胞圖。由圖可知，水冬瓜葉表皮細胞排列緊密，形狀較規則，類長方形，垂周壁的兩個寬邊為近平直形，垂周壁的兩個長邊為近平直形或雙曲弧形，非腺毛分布較多；葉上表皮多類圓形或卵圓形，排列緊密，垂周壁波狀彎曲形，可見平軸式氣孔與螺紋導管。

圖3 水冬瓜葉表皮細胞圖（×40）Fig.3 Pictures of epidermal cells for Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia (Harms) Hu leaves

2.2.2 水冬瓜葉粉末特征

如圖4 所示，水冬瓜葉粉末呈草綠色。水合氯醛片可見平軸式氣孔，數量較多。水合氯醛透化片，可見螺紋導管，側面觀呈同心圓等間距梯度排列，排列較緊密，由一系列筒狀的死細胞橫壁溶解形成穿孔通道連接而成；草酸鈣方晶可見。

圖4 水冬瓜葉粉末特征圖（×40）Fig.4 Pictures of Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia (Harms) Hu leaves powders

2.3 NIR鑒別結果

圖5 為樣品的近紅外原始光譜3D圖。PCA模型驗證鑒別結果見圖6。由圖6a可見，近紅外Classification Table（分類表）結果欄中正品后標識為“*”；近紅外分類繪圖（Plot）方法采用Si vs Hi方法時，由圖6b可見，水冬瓜根皮、水冬瓜樹皮、水冬瓜葉分布在不同區域，其中正品水冬瓜葉樣品“Y43～Y48”分布在“3-區” ，而水冬瓜根皮、水冬瓜樹皮分布在其他區域。構建的NIR定性鑒別模型快速、準確地識別了正品樣品“Y43～Y48”。結果表明：該鑒別模型可用于水冬瓜葉藥材的真偽鑒別與質量控制。

圖5 水冬瓜葉近紅外3D圖Fig.5 NIR-FTIR spectra of Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia (Harms) Hu leaves

圖6 水冬瓜葉NIR模型鑒別結果Fig.6 Model identification results of Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia (Harms) Hu leaves

3 結論

通過對貴州特色民族藥——落葉小喬木水冬瓜葉進行性狀鑒別、表皮細胞與藥材粉末顯微特征組織學鑒別研究，得出如下結論：落葉小喬木水冬瓜葉互生，呈闊心形，先端漸尖；表皮細胞體積膨大，附有非腺毛、表面有氣孔；落葉小喬木水冬瓜葉藥材粉末鑒別特征包括平軸式氣孔、螺紋導管及草酸鈣方晶，這與文獻報道的根皮部位具有韌皮纖維、具緣紋孔導管、木栓組織碎塊、淀粉粒粉末顯微組織學特征不同，可作為區分山茱萸科植物有齒鞘柄木不同用藥部位的顯微鑒別特征[25]。通過優化定性定量近紅外建模方法及綜合利用紅外光譜技術（IR）[28]、近紅外光譜技術（NIR）可對落葉小喬木水冬瓜葉進行快速真偽鑒別及質量評價，且綠色、準確、簡便，應用前景廣。

由于落葉小喬木水冬瓜葉藥材物質基礎相關研究較少，因此，后期以藥效物質研究為基礎，可對其開展薄層色譜（TLC）鑒別及化學成分的液質聯用（LC-MS）、氣質聯用（GC-MS）快速分析研究[29]，有關研究有待進一步深入。