基于高通量測序白及根部內生真菌的物種組成分析

鄧文祥趙漫麗王自林李永梅

（1.云南農業大學資源與環境學院，云南 昆明 650201；2.云南農問農業科技有限公司，云南 昆明 650201；3.云南農業大學植物保護學院，云南 昆明 650201；4.云南城市建設職業學院，云南 昆明 651700）

白及（Bletilla striata）是地生蘭科白及屬多年生草本植物，莖基部具膨大假鱗莖，肉質，富黏性，生數條細長根[1]。白及用于止血，散熱利濕，消腫、生肌等人體病癥，是我國較為常見的中藥材[2]。白及塊莖已經在工業和食品等領域得到了廣泛應用，其藥用成分白及多糖則被廣泛應用于臨床醫學[3]。研究表明，內生真菌在蘭科植物整個生長史中有著不可替代的作用：在種子萌發，水分、養分吸收，抗病，促生等領域發揮著重要作用，能夠促進植株生長。同時，藥用植物內生真菌在有效成分合成過程中，起著積極的誘導作用[4-5]。成熟白及種子細小，胚發育不全，且無胚乳[6]，僅依靠自身營養物質，難于在自然條件下萌發。所以外源養分對其種子萌發具有重要意義。

本研究于2009—2017年不間斷對白及種子進行無菌化培養，利用實驗室條件提供充足氮、磷、鉀和微量元素，以及添加劑和植物生長調節劑對其進行調控，能夠較好的促進白及種子無菌萌發，并能得到較為茁壯的幼苗。但在白及煉苗過程中，白及幼苗總會受到外來病原菌侵染，根部、假鱗莖與葉片結合部位出現腐爛癥狀，在采取化學、物理防治后，也不能有效控制該病情的發生。

近年來，國內外關于白及藥理、組培、化學、資源等領域的研究較多。關于白及和黃花白及（Bletilla ochracea）內生真菌組成及多樣性研究，已有少量報道[7-8]，但都是對可培養型內生真菌進行分析研究，劉準等研究表明[8]，僅對黃花白及可培養型內生真菌的多樣性分析，其多樣性指數往往會被低估。有關云南白及根部內生真菌物種組成和種群差異的研究報道較少，本研究旨在應用高通量測序，對白及根部內生真菌物種豐度和種群差異進行分析，深入了解云南原生境白及根部內生真菌組成和分布情況，為后續相關生防菌株資源培養與篩選提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 植株材料

供試植株主要采集于云南省楚雄市南華縣緩坡灌木林下雜草叢中，該地年降雨量為823 mm，采集到不同地理位置的白及植株樣品3個，HCN 1共計采集14苗，HCN 2共計采集9苗，HCN 3共計采集15苗，共采集38苗。采樣過程中，同時將白及根部土壤一起采集，確保植株根系完整。楚雄市南華縣位于云南中部，楚雄市西部，南華縣地處低緯度高海拔地區，以北亞熱帶季風氣候為主，兼有大陸性和海洋性氣候特點，立體氣候明顯。據本研究調查，該采樣區域自2015年至今，降雨量偏少，且降雨不均，局部干旱時有發生，植被覆蓋率較其他采樣區域較低。采集植株樣品生境見表1。

表 1 采集植株樣品生境Table 1 Physical environment of sampling sites

1.2 試驗方法

1.2.1 根部表面消毒

具體包括以下步驟：1）選取健康成活植株；2）自來水流動沖洗根表面，直至去除表面附著物；3）采用國家發明專利ZL 2015101400150.7[9]進行無菌化處理，先用質量分數3‰～10‰吐溫、0.1‰～2.0‰K2MnO4、1%～3% NaClO、0.1%HgCl2，各試劑依次處理1.5 min，用無菌水沖洗4～6次，再用以上4種試劑重復處理1次，最后再無菌水沖洗4～6次，處理結束后，置于無菌環境中備用。

1.2.2 基因組DNA提取

使用特定的DNA提取試劑盒（QIAGEN，德國）進行基因組DNA提取后，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。

1.2.3 PCR擴增

引物：ITS3_KYO2(5′ ? GATGAAGAACGYAGYRAA?3′)和 ITS4(5′?TCCTCCGCTTATTGATATGC?3′)[10]以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區域的選擇，使用帶Barcode的特異引物進行PCR。每1個25 μL的體系包括1×PCR buffer、1.5 mmol/L MgCl2、0.4 μmol/L dNTPs、正向和反向引物各1.0 μmol/L、0.5 U KOD?Plus?Neo 酶（TOYOBO）和 10 ng 模板。PCR程序包括起始 94 ℃ 1 min，然后 30個 循環（變性 94 ℃20 s，退火 48 ℃ 30 s和 延伸 72 ℃ 30 s），最后 72 ℃5 min。每個樣本進行3個PCR技術重復。

1.2.4 PCR 產物檢測、純化和定量

PCR 與 1/6 體積的 6X loading buffer 混合，使用 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。取目的條帶用來回收，回 收 使 用 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)。使 用Qubit@ 2.0 Fluorometer(Thermo Scientific)定量，最后等摩爾量混合。

1.2.5 建庫和測序

建庫使用 TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit，構建好的文庫經過定量和文庫檢測合格后，使用羅寧生物科技公司的Hiseq 2500平臺PE250模式測序。

1.3 數據分析

1.3.1 序列處理

使用FLASH[11]拼接雙端序列?；贐arcode從reads中拆分出各樣品序列。截去Barcode序列得到原始數據，然后使用Trimmomatic[12]進行質控。得到有效數據Clean Reads。

1.3.2 聚類分析

基于Usearch（http://drive5.com/uparse/）軟件，使用UPARSE算法[13]在97%的一致性水平上進行OTU聚類，挑選每個OTU中出現頻數最高的序列作為OTU的代表序列。使用UCLUST分類法[14]與UNITE 數據庫（https://unite.ut.ee/）進行注釋分析。使用MAFFT version 7 的 FFT?NS?2算法[15]將代表性序列進行多重比對。使用Fast-Tree[16]構建進化樹。對各樣本做均一化處理，以樣品中數據量最少的為標準進行重抽樣。

1.3.3 群落組成分析

使用R語言[17]進行各種數據轉換。使用ggplot2包作圖。使用R語言中phyloseq包提取特定分類水平的群落組成，并使用mean函數計算各組樣品中各物種的均值，使用pheatmap包繪制熱圖。為了方便展示關注的物種分類層次、物種豐度以及樣本間的比較，使用特定的物種分類樹進行研究。步驟為對每個樣品的物種分類結果，篩選特別關注的物種（選擇最大相對豐度前10的屬）進行物種分類樹統計，3個樣品中的特定物種分類樹將進行比較分析。應用SPSS 17.0 分析各樣本內生真菌豐度與采樣點土壤因子的相關性。

2 結果與分析

2.1 內生真菌的系統發育分析

選取豐度排名前50的OTU進行系統發育（圖1）分析，明顯分為子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota），置信度均大于95%。

圖 1 高豐度OTU系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the high abundance OTU

子囊菌門，在樣本HCN 1和HCN 3中，Leoti omycetes、Erysiphales、Erysiphaceae的Podosphaera和Erysiphe在相近發育枝上，置信度大于95%；在樣本HCN 1和HCN 3中，Eurotiomycetes、Eurotiales、Trichocomaceae、Aspergillus的Aspergillussp.在同一發育枝之上，置信度大于95%；在樣本HCN 1、HCN 2、HCN 3中，Sordariomycetes、Incertae sedis、Glomerellaceae、Glomerella的Glomerella cingulata的置信度為90%；Dothideomycetes、Botryosphaeriales、Botryosphaeriaceae的Phyllosticta置信度大于95%。

擔子菌門中，Microbotryomycetes、Sporidiobolales、Incertae sedis，Rhodosporidium的Rhodosporidium diobovatum和Agaricostilbomycetes、Agaricostilbales、Agaricostilbaceae、Sterigmatomyces的S. halophilus在相近發育枝上，在樣本HCN 1、HCN 2、HCN 3中，置信度為89%。

2.2 內生真菌群落分布及組成分析

如圖2所示，樣品HCN 1、HCN 2、HCN 3中，Ascomycota豐度分別為98.48%、95.70%、96.71%；Basidiomycota豐度分別為0.51%、4.30%、1.52%。

圖 2 高豐度門水平類群熱圖Fig.2 Heatmap of high abundance at the phylum level

如圖3所示，樣品HCN 1、HCN 2、HCN 3中，Dothideomycetes豐度均最高，依次分別為95.95%、93.92%、91.90%；Eurotiomycetes豐度依次為1.07%、0.51%、2.53%；Sordariomycetes豐度依次為0.25%、1.27%、1.27%；Agaricostilbomycetes豐度依次為0.51%、0.51%、0.25%；Tremellomycetes豐 度 為2.78%（HCN 2）、0.25%（HCN 3）；Leotiomycetes豐度為0.76%（HCN 1）、1.01%（HCN 3）；Agaricomycetes豐 度為1.01%（HCN 2）；Exobasidiomycetes和Microbotryomycetes在HCN 3中豐度均為0.51%。

如圖4所示，在目水平上，樣品HCN 1中物種豐度大小依次為Capnodiales 2.03%、Botryosphaeriales 1.77%、Erysiphales和Agaricostilbales豐度 均 為0.51%、Eurotiales 1.01%、Incertae sedis 0.25%；樣品HCN 2中物種豐度大小依次為Incertae sedis 1.27%、Eurotiales 和Agaricostilbales均為0.51%，Pleosporales、Capnodiales、Botryosphaeriales、Cystofilobasidiales和Polyporales豐度均為0.25%；樣品HCN 3中物種豐度依次為Botryosphaeriales 2.78%、Eurotiales 2.53%、Incertae sedis 1.27%、Capnodiales和Erysiphales豐度均是 1.01%，Pleosporales、Microstromatales 和Sporidiobolales豐度均為 0.51%，Agaricostilbales 和Cystofilobasidiales豐度均是 0.25%。

圖 3 高豐度綱水平類群熱圖Fig.3 Heatmap of high abundance at the class level

如圖5所示，在科水平上，樣品HCN 1中物種豐度大小依次為Botryosphaeriaceae 1.77%、Erysiphaceae和Mycosphaerellaceae均為0.76%、Trichocomaceae和Agaricostilbaceae均為0.51%、Glomerellaceae 0.25%；樣品HCN 2中物種豐度大小依 次 為Glomerellaceae 1.27%、Agaricostilbaceae 0.51%，Botryosphaeriaceae、Mycosphaerellaceae、Montagnulaceae、Cystofilobasidiaceae、Polyporaceae豐度均為0.25%；樣品HCN 3中物種豐度大小 依 次 為Botryosphaeriaceae 2.78%、Trichocomaceae 2.28%、Glomerellaceae 1.27%、Erysiphaceae 1.01%、Montagnulaceae和Incertae sedis均為0.51%，Agaricostilbaceae、Mycosphaerellaceae、Cystofilobasidiaceae 豐度均為0.25%。

如圖6所示，選擇在屬水平上物種豐度排名前50的進行排序，生成熱圖進行群落組成分析。樣品HCN 1中各菌屬豐度從大到小依次為：Phyllosticta1.77%、Aspergillus0.51%、Erysiphe0.51%、Sterigmatomyces halophilus0.51%、Podosphaera

0.25%、Glomerella cingulate0.25%；樣 品HCN 2中各菌屬豐度從大到小依次為：Glomerella cingulate1.27%、Sterigmatomyces halophilus0.51%、Phyllosticta0.25%；在樣品HCN 3中各菌屬豐度從大到小依次為：Phyllosticta2.78%、Aspergillus

1.27%、Erysiphe1.01%、Sterigmatomyces halophilus0.25%、Rhodosporidium diobovatum0.51%。

如圖7所示，選擇在種水平上物種豐度進行排序，樣品HCN 1、HCN 2、HCN 3 中，Glomerella cingulata豐度依次為0.25%、1.27%、1.27%，Sterigmatomyces halophilus豐 度 依 次 為0.51%、0.51%、0.25%，Dothideomycetessp.豐度依次為0.51%、2.53%、0.76%；樣品HCN 1中，Ascomycotasp.的豐度為0.51%；樣品HCN 2中Tremellomycetessp.的豐度為2.03%；樣品HCN 3中，Aspergillussp.的 豐 度 為1.01%，Rhodosporidium diobovatum的豐度為0.51%。

圖 4 高豐度目水平類群熱圖Fig.4 Heatmap of high abundance at the order level

圖 5 高豐度科水平類群熱圖Fig.5 Heatmap of high abundance at the family level

圖 6 在屬水平的高豐度熱圖Fig.6 Heatmap of high abundance at the genus level

圖 7 高豐度種水平類群熱圖Fig.7 Heatmap of high abundance at the species level

2.3 特定物種分類樹分析

對HCN 1、HCN 2、HCN 3 樣本中豐度前10的屬進行特定物種分類樹分析。由圖2～8可知：子囊菌門占總樣本群落豐度的96.46%。是該采樣點的優勢菌門。擔子菌門，占物種總豐度的2.11%。Sterigmatomyces halophilus占物種總豐度的0.42%，占該分類層次物種豐度的11.9%，是HCN 1、HCN 2、HCN 3 樣本中共有菌屬；子囊菌門，占總物種豐度的96.96%。Podosphaera和Erysiphe分別占物種總豐度的0.08%、0.51%，分別占該Erysiphaceae分類層次物種豐度的2.38%和14.29%，其中，Podosphaera是HCN 1中獨有菌屬，關于Erysiphe物種豐度，HCN 3高于HCN 1樣本中豐度；Aspergillus占總物種豐度的0.93%，占Trichocomaceae分類層次物種豐度的26.19%，HCN 3高于HCN 1樣本中豐度；Phyllosticta占總物種豐度的1.6%，占Botryosphaeriales分類層的45.24%，樣品HCN 3、HCN 1、HCN 2物種豐度依次降低。

圖 8 特定物種分類樹Fig.8 Specific taxonomic tree

2.4 內生真菌物種豐度與土壤理化性質相關性分析

如表2所示，3個采樣區域中，根部土壤pH、全碳、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、速效磷、速效鉀均有一定的正負相關性。其中，HCN 1和HCN 3樣品物種豐度與全氮顯著正相關；HCN 3物種豐度與全磷顯著負相關，HCN 2物種豐度與速效鉀極顯著負相關。

表 2 不同采樣點根部內生真菌物種豐度與土壤因子的相關性分析Table 2 Correlation analysis of endophytic fungus species abundance and soil factors in different collection sites

3 結論與討論

該采樣區域的白及植株根部內生真菌主要是擔子菌門，豐度值為2.11%，子囊菌門，豐度高達96.96%，是該區域的優勢菌門。

Phyllosticta是 樣 本HCN 1、HCN 2、HCN 3中豐度均在前10的物種，是高豐度菌屬。有研究證明，Phyllosticta是廣泛引起世界范圍內植物葉枯病和葉斑病的主要致病菌，在果樹上病癥表現尤為突出[18]，但也有研究證明Phyllosticta capitalensis和P. paracapitalensis對P. citricarpa具 有拮抗作用[19]。Erysiphe在HCN 1和HCN 3豐度分別在0.51%和1.01%。研究發現，Erysiphe對大多植物有致病性[20]，Erysiphe中的白粉菌是常見的專性寄生真菌，能夠侵染多種瓜果類農作物，并造成嚴重危害[21]，本研究關于白及屬植物病害調查也發現，白粉病時有發生。與Erysiphe處于相近發育枝的Podosphaera也是引起植物白粉病的重要病原菌[22-24]。在樣本HCN 1、HCN 2、HCN 3中的豐度均在前10的物種還有Glomerella cingulata，豐度均處于較高水平。研究表明，Glomerella cingulata對果蔬和花卉植物均具有致病性[25-29]。在蘭科石斛中Glomerella也被分離出來，是石斛根部內生真菌的優勢菌屬[30]。Glomerella cingulata與蘋果GlomerellaLeaf Spot密切相關[31]；該屬對辣椒、橄欖、山茶花、雪松，蘋果等植物都有致病性[25,27,29]。同時也是引起蘭科植物鐵皮石斛炭疽病的病原菌之一[32]。

而在樣本HCN 1、HCN 3中存在的Aspergillus在植物生防領域有著積極作用[33-34]，特別是Aspergillus versicolor次生代謝產物中的吲哚?3?乙酸（IAA）和氨，促進共生植株根、莖、葉的生長[35-36]。從大豆根部分離的Aspergillus fumigatussp.LH02，能夠顯著增加大豆植株莖長、鮮干質量、葉面積、葉綠素含量[37]。Aspergillussp.KJ-9的7種代謝產物對Gibberella saubinetti、Magnaporthe grisea、Botrytis cinerea、Colletotrichum gloeosporioides、Alternaria solani等致病菌有抑制作用[38]。Rhodosporidium diobovatum在HXJ1和HXJ2中的豐度均為1.27%。已有研究結果表明，該菌種的代謝產物對植物促生和生防也有較好效果[39]。Rhodosporidium toruloides是一種多用途真菌，能產生生物催化劑、氨基酸、脂質等物質[40-41]，R. toruloidesY4對木質纖維素衍生的抑制劑具有較好的耐受性[42]。

擔 子 菌 門 中，Sterigmatomyces halophilus在3個樣本中均有分布，Antunes和Aguiar對Sterigmatomyces halophilus進行了系統性描述，并指出該菌種在生態和工業中有較好應用前景，其代謝產物在生防領域也有較好利用價值，可作為生防菌株研究利用[43]，同時Sterigmatomyces halophilus對土壤重金屬有較好的吸附性，具有一定的生態修復功能[44]。

在各樣本中同時有病原菌和生防菌株的存在，但植株并未見明顯的患病病癥。分析發現，在樣品HCN 1、HCN 2、HCN 3中，Phyllosticta、

Aspergillus、Sterigmatomyces halophilus、Rhodosporidium diobovatum等菌屬已經在其他植物研究中被發現具有促生和生防作用。本研究中，以上物種在屬種水平上豐度總體處于優勢地位，豐度高于Glomerella cingulata、Erysiphe、Podosphaera等已經被公認的致病菌豐度值。3個不同采樣點白及根部組織中存在一定豐度的致病菌，同時也有較高豐度的益生真菌共存。這一結果為后續益生白及內生真菌篩選和致病菌分析提供了依據。

3個樣品間的采樣距離和地理位置差異是引起白及根部內生真菌組成差異的影響因子之一。不同的土壤理化性質與白及根部內生真菌物種豐度之間存在直接相關性，是白及根部內生真菌物種組成差異的主要影響因素。