鹽脅迫和溫度對桑樹種子萌發及幼苗生長的影響

黃 恒付錦雪曹幫華趙文軒郝木征毛培利王甜甜郝迎東張希畫譚海濤

（1.山東農業大學林學院黃河下游森林培育國家林業局重點實驗室，山東泰山森林生態系統國家定位觀測研究站，山東 泰安 271018；2.東營市園林綠化中心，山東 東營 257091；3.山東黃河三角洲國家級自然保護區，山東 東營 257500）

桑樹（Morus alba）是我國重要的鄉土樹種，經濟價值高，適應能力強，是防沙治沙、石漠化治理、水土保持、鹽堿地治理等的重要生態樹種[1]。黃河三角洲地區桑樹已有多年的栽植歷史[2-3]。野外調查發現，該地區的刺槐（Robinia pseudoacacia）林內有著天然更新的不同樹齡的桑樹種群，這表明桑樹在濱海鹽堿地區有著一定的天然更新能力。因此，深入研究桑樹種子的耐鹽性及與其他環境因子的共同作用，有利于找出在濱海鹽堿地區種子萌發階段的主要限制因子，對促進生態環境建設有著重要意義。種子萌發是實現植物種群更新和物種延續的關鍵環節，是整個植物最為脆弱的關鍵階段之一。鹽脅迫和溫度是影響植物種子萌發的重要環境因子[4-8]。大量的研究表明，鹽脅迫顯著抑制了植物種子的萌發[8-14]、萌芽幼苗的大小和胚根的長度[15-16]。但耐鹽能力較強植物的種子在低鹽下萌發受影響不大[17-20]，甚至有促進作用[14,21]。環境溫度是影響種子萌發的另一個重要因子，顯著影響萌發過程中種子內部的酶活性、各種代謝反應[11,22]。隨溫度的增加，種子發芽率（G）、發芽速率增加[11,20,23]，但過高的溫度種子萌發會受到抑制[18,24]，這與植物種子萌發的最低、最適和最高溫度范圍有關[25]。許多研究發現鹽脅迫與環境溫度對種子萌發有著顯著的交互作用[14-15,26]。一些鹽生植物充分利用溫度和鹽濃度的變化形成了適應鹽堿地的特有方式，如堿蓬（Suaeda salsa）[18]、紫花苜蓿（Medicago sativa）[10]、沙棘（Hippophae rhamnoides）[27]、錦雞兒（Caragana turkestanica）[19]、黃花苜蓿（Medicago falcata）[28]、鹽節木（Halocnemum strobilaceum）[29]、豬毛蒿（Artemisia scoparia）[14]等。

研究發現桑樹有著較強的耐鹽萌發能力[30-31]，其耐鹽能力與種子的來源地域[32]、品種[17,33]有關。于振旭等[34]研究發現，桑樹2年生幼苗在土壤含鹽量為1.5‰～4.5‰時部分生理生化指標變化差異不顯著。柯裕州[30]發現桑樹種子萌發階段的耐鹽能力低于幼苗階段，對鹽分更敏感，鹽脅迫顯著抑制了桑樹1年生幼苗的根系生長發育，降低了根冠比（R/S）。桑樹種子萌發的適宜溫度為25～35 ℃[27]。桑樹種子在濱海鹽堿地區萌發過程中會同時受到鹽分和環境溫度的影響，因此系統研究鹽脅迫與環境溫度對桑樹種子萌發的交互作用有利于闡明其在萌發階段的適應性。本研究探討了鹽脅迫和溫度對桑樹種子萌發和幼苗生長的影響，從種子萌發、幼苗生物量（SB）、生物量分配及根系形態上闡明了二者的作用機制，探討了2種因素共同作用下對種子萌發的影響，以期為桑樹林在濱海鹽堿地區應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 種子采集與處理

試驗用的桑樹種子采集于山東農業大學林學實驗基地（117°15′E，36°17′N）。桑樹的年齡為16 a，主要用于生產桑葉，用來養蠶。株行距一般為1.8 m×0.3 m，每年6月初從距離地面40～50 cm處截干。2018年5月30日采集紫黑色成熟果實，在通風處陰干，篩出種子，挑選飽滿種子用于試驗。種子千粒質量為1.740 g。

1.2 種子萌發實驗設置

將采集的種子分別于不同NaCl濃度和溫度下進行萌發試驗。NaCl濃度分別為0（CK）、3‰、5‰、7‰，溫度分別為21 ℃（Ⅰ）、30 ℃（Ⅱ）和39 ℃（Ⅲ）。將種子于30 ℃水中浸種24 h后用75%乙醇消毒10 min，再用蒸餾水進行沖洗，吸干表面水分，置于已滅菌的培養皿內。種子置入前培養皿內放置滅菌的海綿和濾紙，加入25 mL鹽溶液或去離子水使濾紙飽和。每個培養皿擺放40粒種子，4次重復，總共48個培養皿，置于經過消毒的人工智能光照培養箱內進行種子萌發。種子萌發以胚根和種子等長為標志[35]。實驗持續21 d，每天觀察記錄1次，記錄每日萌發數和種子萌發起始時間。

培養21 d后結束試驗，將幼苗分為地上和根系2部分，每盤選取平均長勢的3株幼苗的根用HP Scanjet 8200掃描儀（惠普，中國）掃描，然后用Delta?T Area Meter Type AMB2根系參數分析軟件分析掃描圖片獲取根長（RL）、根系表面積（RSA）和根系直徑（RD）。然后將地上部分和根系分放于烘箱內（80 ℃，48 h）進行烘干至恒質量，稱量記錄干質量。按公式（1）～（5）計算SB、G、平均發芽時間（MGT）、發芽指數（GI）、活力指數（VI）、R/S。

式中：G1為萌發數，N為供試種子總數，n為相應各日正常發芽粒數，D為從種子置床起的天數，Gt為各日凈發芽數，Dt為相應發芽日，S為幼苗干質量。

1.3 數據分析

所有數據采用SPSS 17.0軟件進行分析。采用雙因子方差分析比較了G、MGT、GI、VI、SB、地上部生物量（AB）、根系生物量（RB）、R/S、RL、RSA和根系直徑的差異，如果差異顯著，再用最小顯著差異法（LSD）進行多重比較；同時，將種子萌發和幼苗生長指標利用Pearson Correlation Coefficient法進行了相關分析，分析時顯著性差異檢驗水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫和溫度對種子萌發的影響

由圖1可知，隨鹽濃度的增加，G、GI和VI都是逐漸降低，MGT逐漸增加；隨溫度的增加，G和GI都逐漸增加，而VI則是先增加再降低，在溫度Ⅱ下最高，MGT則是逐漸降低。由表1可知，鹽濃度對G、GI和VI有著極顯著影響（P＜0.01），對MGT有著顯著影響（P＜0.05）；溫度對上述指標都有著極顯著影響（P＜0.01）；二者在G、GI、VI上沒有顯著交互作用，但對MGT有著顯著的交互作用（P＜0.05）。

圖 1 鹽脅迫和溫度對桑樹種子萌發的影響Fig.1 Effects of salt stress and temperature on germination ofM. albaseeds

不同鹽濃度之間，G差異顯著（P＜0.05），且表現為CK≈3‰＞5‰＞7‰，MGT為CK≈3‰＜5‰＜7‰（P＜0.05），GI和VI為CK＞3‰＞5‰＞7‰（P＜0.01）。不同溫度之間，G和GI為Ⅰ＜Ⅱ＜Ⅲ（P＜0.01），MGT為Ⅰ＞Ⅱ≈Ⅲ（P＜0.05），VI為Ⅰ＜Ⅱ≈Ⅲ（P＜0.05）。在交互作用上，隨著鹽濃度的增加，溫度越高MGT越短。

2.2 鹽脅迫和溫度對SB及R/S的影響

由圖2可知，隨鹽濃度的增加，SB、RB和R/S逐漸降低，AB波動變化；隨著溫度的增加，SB、RB和R/S都是溫度Ⅱ最高，AB也是波動變化。結合表1可知，鹽脅迫和溫度都對SB、RB和R/S有著極顯著影響（P＜0.01），對AB影響不顯著；在交互作用上，二者對SB和AB沒有顯著影響，但對RB有顯著影響（P＜0.05），對R/S有極顯著影響（P＜0.01）。

圖 2 鹽脅迫和溫度下桑樹SB及分配的變化Fig.2 Changes of biomass and distribution ofM. albaseedlings under salt stress and temperature

表 1 鹽濃度和溫度對桑樹種子萌發和幼苗指標的雙因素方差分析Table 1 Two-way analysis of variance ofM. albaseed germination and seedling indexes by salt concentration and temperature

不同鹽脅迫之間，SB、RB在CK和3‰下差異不顯著，極顯著大于7‰（P＜0.01）；R/S在CK下最大（P＜0.01），而在3‰、5‰和7‰之間差異不顯著。不同溫度之間，溫度Ⅱ下有著最大SB、RB和R/S（P＜0.01）。在交互作用上，RB和R/S在溫度Ⅱ下隨鹽濃度增加而降低。

2.3 鹽脅迫和溫度對幼苗根系形態的影響

由圖3可知，隨鹽濃度的增加，RL、RSA逐漸降低，根平均直徑逐漸增加。結合表1可知，鹽濃度和溫度都對RL、RSA和RD有著極顯著影響（P＜0.01），二者對上述指標沒有顯著的交互作用。不同鹽濃度之間，RL在CK下顯著大于3‰下（P＜0.05），二者顯著大于其他鹽濃度（P＜0.05）；RSA在CK和3‰下差異不顯著，二者顯著大于其他鹽濃度（P＜0.05）；RD在CK下最大，其他鹽濃度之間差異不顯著。不同溫度之間，溫度Ⅱ下的RL和RSA極顯著大于溫度Ⅰ和Ⅲ下的（P＜0.01），Ⅰ與Ⅲ差異不顯著；溫度Ⅰ下的RD極顯著大于溫度Ⅱ與Ⅲ下的（P＜0.01），Ⅱ與Ⅲ差異不顯著。

2.4 種子萌發和幼苗生長指標之間相關分析

由表2可知，在種子萌發指標之間，G、MGT、GI和VI之間都有著極顯著的相關（P＜0.01），其中G、GI和VI之間為極顯著正相關（P＜0.01），三者與MGT為極顯著負相關（P＜0.01）。在幼苗生長指標之間，SB與AB、RB、R/S、RL和RSA成極顯著正相關（P＜0.01）。根系特征之間，RB、R/S、RL和RSA之間成極顯著正相關（P＜0.01），RB和R/S與根直徑之間成顯著負相關（P＜0.05），RL和RSA之間成極顯著負相關（P＜0.01）。在種子萌發指標和幼苗生長指標之間，G、GI和VI與根直徑成極顯著負相關（P＜0.01），而MGT與根直徑成極顯著負相關（P＜0.01）；VI與SB成極顯著正相關（P＜0.01），與RB、R/S、RL和RSA成極顯著正相關（P＜0.01），與RD成極顯著負相關（P＜0.01）。

圖 3 鹽脅迫和溫度下桑樹幼苗根系形態的變化Fig.3 Changes of root morphology ofM. alba seedlings under salt stress and temperature

表 2 桑樹種子萌發和幼苗生長指標之間相關分析Table 2 Correlation analysis between seed germination and seedling growth indexes ofM. alba

3 結論與討論

研究發現，隨鹽濃度的升高，桑樹種子的G、GI和VI逐漸降低，MGT逐漸增長，種子萌發受到抑制，這與張國英等[31]對桑樹種子萌發的研究結果一致。對油葵（Helianthus annuus）[10,36]、紫花苜蓿[10]、蒼耳（Xanthium sibiricum）[11]、地梢瓜（Cynanchum thesioides）和牧豆（Prosopis juliflora）[37]等、黃花磯松（Limonium aureum）[4]、云杉（Picea asperata）[5]、興安杜鵑（Rhododendron dauricum）[6]、中國石竹（Dianthus chinensis）和常夏石竹（Dianthus plumariu）[9]等植物的研究，也發現種子萌發顯著受到鹽脅迫抑制。本研究發現桑樹種子的G在CK與3‰之間差異不顯著。其他對桑樹種子萌發的試驗發現鹽濃度不超過3‰[30-31]或4‰[17,29]對其萌發影響不大，這表明桑樹有一定的耐鹽能力。隨鹽濃度增加種子萌發受到抑制的原因，一方面可能是NaCl的單鹽毒害加劇，另一方面可能是由于離子濃度增大，滲透作用增強導致[29]。在21 ℃桑樹種子的G、GI和VI均為最低，與在低溫環境下種子吸水困難，酶活性降低有關[38]。隨溫度的增加，桑樹種子的G、GI和VI顯著增加，與油葵[36]、小麥（Triticum aestivum）[26]的研究結果相似。這可能與溫度增加，提高了種子內部的酶活性等有關[39]。許多研究發現隨溫度的增加植物種子的G先增加再降低，其最適發芽溫度一般處于受試溫度區間的中間值[24,28,40]。在MGT上有著鹽脅迫和溫度有著顯著的交互作用，鹽濃度越低，溫度越高，MGT越短。種子快速的萌發可以增加幼苗的生長時間，提高幼苗抗逆能力[41]。陳宣等[42]認為25～35 ℃是桑樹適宜的發芽溫度，表現出明顯的喜溫特性。桑樹種子于5月下旬及6月初成熟，6月份溫度較高[43-44]，達到其萌發的最適溫度。因此在水分充足的條件下，在土壤含鹽量較低的土壤中快速萌發，可能是其適應濱海鹽堿地的重要方式。

萌發過程中SB是反映種子活力的重要指標。隨著鹽脅迫濃度的增加，桑樹幼苗的生物量逐漸降低，這與張國英等[31]對桑樹種子萌發研究和劉偉娜[45]對刺槐種子研究的結果一致。雷舒涵等[24]也發現鹽脅迫顯著抑制了7個野生觀賞草種子萌發的SB。Vahabinia等[8]發現菊苣（Cichorium intybus）幼苗質量也顯著受到鹽脅迫抑制。本研究發現桑樹幼苗AB隨鹽濃度增加變化不顯著，但RB顯著降低，表明鹽脅迫抑制根系生長的作用大于地上部分，與祝娟娟等[17]、張國英等[31]的研究結果一致。柯裕州[30]也發現鹽脅迫下桑樹1年生幼苗的根系受抑制程度明顯高于地上部分。在生物量分配上，桑樹幼苗的R/S在鹽脅迫下逐漸降低，與柯裕州[30]、張國英等[31]的研究結果一致，表明R/S是反應桑樹受到鹽脅迫危害的較好指標。

隨溫度的增加（除鹽濃度7‰外），桑樹SB先增加再降低，在中間溫度30 ℃最高。陳宣等[42]也發現桑樹的萌芽幼苗鮮質量和干質量都是在中間溫度35 ℃最高。王玉芳等[46]發現紅花大金元幼苗鮮質量也是先增加再降低，中間溫度25 ℃最高。對于SB在超過適宜溫度下的降低，陳玉梁[36]認為高溫下種子呼吸加強，物質代謝加快，加速了儲藏物質的消耗，對幼苗生長造成高溫傷害。周洋等[40]認為與溫度過高影響了營養物質的合成與傳遞，對幼苗后期的生長不利有關。在生物量分配上，R/S在中間溫度30 ℃最高，而且隨鹽濃度降低而增加。相關分析表明，SB與RB和R/S成極顯著正相關。R/S在鹽脅迫下的增加提高了植物的耐鹽能力[42]。因此，適當高溫提高了桑樹種子的耐鹽能力。另外，本研究發現在溫度30 ℃時，SB較其他2個受試溫度高，而在39 ℃時，種子的G最高，這表明桑樹在種子萌發和幼苗生長上對溫度的適應不完全一致。

根系是植物首先感受土壤環境的器官。大量的研究表明，鹽脅迫下植物種子萌發時胚根的生長受到顯著抑制[17-18,23-24,31,47]。有研究表明當黃瓜幼苗受到Ca(NO3)2和NaCl脅迫時，RL度和RL均顯著下降，但側根密度和RD明顯增加，根尖短而腫大，整根生長成簇，根系活力顯著增加[48]。本研究發現桑樹幼苗RL在3‰就已經比CK顯著降低，RD則是顯著增加。隨著鹽脅迫濃度的增加，桑樹幼苗RL、RSA減小，顯著抑制了根系的生長發育，這表明根系特征對鹽脅迫非常敏感。杜建勛等[33]發現鹽脅迫抑制了桑樹種子萌發時幼苗根系的長度生長。這與柯裕州[30]對桑樹1年生幼苗的研究結果一致。Vahabinia等[8]發現菊苣幼苗RL也顯著受到鹽脅迫抑制。Mao等[41]研究了鹽脅迫下刺槐幼苗的根系發育，發現隨著鹽濃度的增加RL、RSA逐漸降低。相關分析表明，SB與RL、RSA、RD成極顯著相關，表明鹽脅迫下根系的發育對幼苗早期生長起到決定作用。隨溫度增加，種子萌發的胚RL度在地梢瓜[12]、發草[24]上都是先增加再降低。本研究發現，桑樹幼苗的RL和RSA都是在中間溫度30 ℃最高，根系發育最好，這是在30 ℃幼苗生長最好的重要原因之一。

一些研究發現，鹽和溫度的交互作用對植物種子的萌發有著重要影響[9,14-15,28-29]，適宜的溫度會促進鹽脅迫下種子的萌發，提高耐鹽能力，如甜高粱（Artemisia scoparia）[15]、石竹[9]和豬毛蒿[14]等。本研究發現，鹽和溫度的交互作用顯著影響了桑樹種子發芽的MGT、RB和R/S。對于MGT，鹽濃度越低，溫度越高，MGT越短。在黃河三角洲濱海鹽堿地區，桑樹種子成熟時的5—6月份平均氣溫已達20 ℃以上，已經有著較大的降雨量[44]。在該地區較大的降雨量可以顯著降低土壤表層的含鹽量[49]。因此，較為適宜的溫度下，在降雨作用下土壤含鹽量降低，這為桑樹種子在野外的快速萌發提供了條件；同時，桑樹RB和R/S也是在30 ℃時鹽濃度越低數值越大，這使得幼苗的發育良好，有著較強的抗逆能力。因此，桑樹種子成熟時的高溫和進入雨季后土壤含鹽量的降低為其種子快速萌發形成健壯的幼苗提供了條件，這可能是其在野外萌發并形成幼苗的重要原因。

桑樹是濱海鹽堿地區的重要經濟和造林樹種。本研究發現，桑樹種子有一定的耐鹽能力，在較低鹽濃度下萌發不受影響，但過高的鹽濃度則顯著抑制其種子萌發；溫度對桑樹種子的萌發有著明顯的調節作用，提高了鹽脅迫下的發芽能力，緩解了鹽脅迫，這表明桑樹的播種育苗在其種子成熟后的高溫夏季進行播種更有利于提高成苗率和苗木質量。鹽脅迫下根系比地上部反應敏感，尤其是根系的形態指標，較低的含鹽量就能顯著抑制根系的發育；適宜的溫度提高了桑樹種子的抗鹽能力，這對探討其在濱海鹽堿地區的天然更新限制機制具有重要的意義。