芹菜素對人腦膠質瘤細胞凋亡作用的研究

曲曉媛 盧強 賈世磊

本文主要研究芹菜素對人腦膠質瘤細胞U87凋亡的影響及機制。方法：應用CCK8法檢測細胞增殖抑制率。流式細胞術檢測細胞周期。Western-blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2及Bax的表達。結果：①芹菜素能抑制膠質瘤細胞U87的增殖。②不同濃度的芹菜素作用24h，G2期細胞所占比例呈下降趨勢。③芹菜素處理組的細胞，Bcl-2蛋白的表達量隨著芹菜素濃度的增加而降低，Bax蛋白的表達量則隨芹菜素濃度的增加而升高。結論：芹菜素能抑制膠質瘤細胞U87的增殖，并可能通過線粒體信號途徑誘導其凋亡。

膠質瘤（glioma）是最常見的惡性程度極高的中樞神經系統腫瘤，占顱內惡性腫瘤的78%左右[1]。膠質瘤起源于神經系統膠質細胞和神經元細胞，是一類高度血管化的腫瘤，具有彌漫性浸潤性生長、侵襲性強、易復發、難切除、預后差[2，3]等特點， 其中位生存期只有一年左右[4-6]。在全身性惡性腫瘤中，惡性膠質瘤5年病死率緊隨胰腺癌和肺癌之后，位居第3位[7，8]。

芹菜素是一種天然的黃酮類化合物[9]，低毒，無誘變性[10]，抗癌譜廣，是抗腫瘤藥研究的熱點之一，但其對膠質瘤的確切作用及機制尚缺乏系統研究。本研究采用芹菜素對人腦膠質瘤細胞系U87進行體外干預，以研究芹菜素對膠質瘤細胞凋亡的影響及機制。

材料與方法

實驗細胞系

選擇人腦膠質瘤細胞系U87作為研究對象，購于北納生物有限公司。

主要試劑

芹菜素和RIPA細胞裂解液購于北京索萊寶科技有限公司;DMEM完全培養液（1×）和CCK8法細胞增殖檢測試劑盒購于江蘇凱基生物技術股份有限公司;兔抗人Bcl-2、兔抗人Bax抗體、GAPDH均為美國CST公司產品;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG為上海碧云天生物技術有限公司產品;PVDF膜為Millipore公司產品。

方法

芹菜素工作液的制備? 原芹菜素濃度是10mmol/mL，需配制成20umol/L、40umol/L和80umol/L。將原芹菜素稀釋1000倍即得到濃度為10umol/mL的芹菜素濃度。依次將2uL、4uL和8uL芹菜素溶解在1mL相應培養基中即可得到所需的實驗濃度。

細胞培養? 將人腦膠質瘤細胞U87置于含有10%胎牛血清、0.2%NaHCO3、0.3%HEPES 的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2 的恒濕孵箱中進行培養。每天觀察細胞生長情況，由于各細胞生長周期不同，每2天換次培養液，3～5天用0.25%的胰酶消化傳代一次，取對數生長期細胞（即培養瓶底布滿80%時）進行實驗。

實驗分組? 實驗共分5組：芹菜素低濃度組（20 umol/L）、芹菜素中濃度組（40 umol/L）、芹菜素高濃度組（80 umol/L）、空白對照組（只加培養基）和陰性對照組（DMSO+培養基）。處理24h后收集所需細胞進行檢測。

CCK8法檢測芹菜素對U87細胞增殖的影響

對細胞鋪板于96孔板貼壁后細胞換液，每孔100ul;每孔加入10ul CCK8試劑，按 20umol/L、40umol/L、80 umol/L濃度梯度設定的芹菜素工作液，分別處理實驗組細胞，置于培養箱中孵育2h;酶標儀在450nm波長下，測吸光度（OD）值。同等條件下重復實驗三次，計算腫瘤細胞的存活率。腫瘤細胞存活率（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

流式細胞術檢測細胞周期

用20umol/L、40umol/L、80 umol/L濃度芹菜素工作液處理U87細胞，培養24h，胰酶消化，PBS洗滌2次，離心，70%乙醇4℃固定過夜，PBS洗滌2次，離心，碘化丙啶染色，室溫避光孵育30分鐘。500ul PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測細胞周期變化。

Western-blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達

用20umol/L、40umol/L、80 umol/L濃度芹菜素工作液處理U87細胞，24h后，收集細胞，3000r/min離心10min后，冰PBS沖洗，加入細胞裂解液，冰上裂解30min后，4℃，10000r/min離心10 min，小心吸取上清，獲得總蛋白并測定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，經十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳1～2h，后濕法轉膜30～50min。加入GAPDH一抗（1：1000）、Bcl-2一抗（1：1000）、Bax一抗（1：1000）孵育，4℃過夜;加入山羊抗兔二抗（1：2000）室溫孵育1～2h。在膜上滴加電化學發光（ECL）顯色液，在凝膠成像系統下成像并測定條帶灰度值。

統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件包處理數據。計量數據用均數±標準差（mean±SD）表示。各項參數值之間的比較分別采用t檢驗和χ2檢驗，以P <0.05為差異有統計學意義。

結果

芹菜素對膠質瘤細胞U87增殖的影響

CCK8法檢測結果顯示芹菜素對膠質瘤細胞U87具有增殖抑制作用。與對照組比較，不同濃度的芹菜素工作液處理24h后，細胞生存率下降，細胞生長明顯受抑制;并且隨著芹菜素濃度的增高，抑制細胞增殖的效果越明顯（圖1）。

流式細胞術檢測細胞周期結果

分別用20umol/L、40umol/L、80 umol/L的芹菜素工作液處理U87細胞24h后，細胞周期各時相所占的比例不相同。隨芹菜素濃度的增加，G2期細胞所占比例呈下降趨勢。但20umol/L和40umol/L的芹菜素抑制細胞增殖的作用不明顯;芹菜素工作濃度增加至80umol/L時，則能明顯抑制細胞的增殖（圖2）。

凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達

分別用20umol/L、40umol/L、80 umol/L的芹菜素工作液處理U87細胞24h后，檢測凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達。隨芹菜素濃度的增加，Bcl-2蛋白的表達量呈下降趨勢，Bax蛋白的表達量呈上升趨勢（圖3）。

討論

近年來，天然植物提取物單體以其對正常細胞毒性小，對惡性腫瘤細胞毒性大和促凋亡而備受青睞。

芹菜素，又稱芹黃素，是一種天然的黃酮類化合物，廣泛存在于自然界中，以植物黃色素的形式在茶葉、蔬菜、水果、豆類和香料中廣泛分布，中藥如地錢、西藏雪蓮花、車前子、絡石藤等中也有很高的含量，其中以芹菜根的含量最為豐富，目前已經可以人工合成。通過大量研究發現芹菜素具有抗腫瘤、抗突變、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗焦慮、保護心血管、保護中樞神經等多種生物活性，其中其抗腫瘤作用最為突出，并且與其他黃酮類物質（ 如槲皮素、山奈黃酮等） 相比，具有低毒性及無誘變性等優點[10]。

芹菜素抗腫瘤作用[11-12]的主要機制有：（1）調控細胞周期運行，抑制腫瘤細胞增殖;（2）誘導腫瘤細胞凋亡;（3）干擾腫瘤細胞信號傳導;（4）抑制腫瘤血管生成、侵襲和轉移。孫悅等[13-14]的研究表明，芹菜素可誘導胃癌細胞凋亡，并且誘導胃癌細胞凋亡的作用呈現藥物濃度依賴性，同時證明芹菜素誘導胃癌細胞凋亡的機制主要是通過Bcl-2/Bax-Caspase-3、Caspase-9的線粒體凋亡通路活化實現的。SHUKLA等[15]研究發現，芹菜素可通過誘導前列腺癌細胞周期阻滯于G2/M期，從而有效抑制前列腺癌細胞的增殖，抑制作用表現出現藥物濃度依賴性。

本研究中，CKK8法檢測結果顯示，芹菜素能抑制膠質瘤細胞U87的增殖;并且隨著芹菜素濃度的增加，對瘤細胞增殖抑制的作用也越明顯，與貢偉一等[16]的研究結果一致。流式細胞術檢測細胞周期的結果顯示，高濃度的芹菜素可明顯減少膠質瘤細胞G2期的細胞數目，提示芹菜素可調控細胞周期的運行，從而抑制腫瘤細胞的增殖能力。在隨后進行的凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax蛋白表達的研究中，我們的結果顯示芹菜素能夠上調Bax蛋白的表達，而Bcl-2蛋白的表達則降低;并且隨著芹菜素濃度的增加，Bax蛋白的表達量呈上升趨勢，Bcl-2蛋白的表達量則呈下降趨勢，提示芹菜素可通過調控凋亡基因、調節參與凋亡的蛋白的表達等方式誘導腫瘤細胞凋亡。此外，不同濃度的芹菜素處理膠質瘤細胞24h后，Bcl-2/Bax比值逐漸降低，我們推測芹菜素可能是通過降低Bcl-2/Bax比值，誘導線粒體依賴的凋亡途徑，從而實現其誘導膠質瘤細胞的目的。

綜上所述，本研究通過研究芹菜素對人腦膠質瘤細胞凋亡的影響，探討芹菜素抗膠質瘤作用的可能機制，以期為中西醫結合治療膠質瘤提供新的思路和方法。

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作者簡介：曲曉媛 碩士，副教授。研究方向：腫瘤病理學。

基金項目：山東省中醫藥科技發展計劃項目“芹菜素對人腦膠質瘤細胞U87、U251體外抗腫瘤作用的實驗研究”（編號：2015-200）。

1.山東中醫藥高等專科學校免病教研室

2.山東省煙臺護士學校臨床教學部