畜禽糞便中氮磷及抗生素的高效檢測(cè)方法研究進(jìn)展

郝斯貝,劉成斌,陳曉燕,毛 舜

畜禽糞便中氮磷及抗生素的高效檢測(cè)方法研究進(jìn)展

郝斯貝,劉成斌,陳曉燕,毛 舜*

(同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200092)

本文對(duì)目前糞便中氮磷和抗生素的常規(guī)檢測(cè)方法和前沿檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了介紹,討論了這些方法的技術(shù)瓶頸和未來(lái)研究方向,并得出以下結(jié)論:1)糞便樣品的常規(guī)檢測(cè)方法具有準(zhǔn)確度高、靈敏度好的特點(diǎn),但需要在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行或需要使用大型儀器,難以滿足原位快速檢測(cè)或在線監(jiān)測(cè)的需要,因此糞便中氮磷、抗生素檢測(cè)新技術(shù)的研究十分必要;2)糞便中的氮磷、抗生素等成分可通過(guò)前處理方法提取,再結(jié)合簡(jiǎn)單、便捷的電化學(xué)法、熒光法等對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),以實(shí)現(xiàn)快速、原位分析或在線監(jiān)測(cè);3)糞便中污染物的高效檢測(cè)技術(shù)在未來(lái)的發(fā)展空間和需求較大,將電化學(xué)法、熒光法等應(yīng)用于糞便中氮磷、抗生素的檢測(cè)需要持續(xù)深入的基礎(chǔ)研究和技術(shù)創(chuàng)新.

畜禽糞便；氮；磷；抗生素；高效檢測(cè)方法

畜禽糞便常通過(guò)堆肥處理施用于農(nóng)田,但糞便中常含有氮磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或抗生素等殘留物,容易造成土壤或者地下水污染.《第二次全國(guó)污染源普查公報(bào)》[1]數(shù)據(jù)顯示,通過(guò)對(duì)涉及全國(guó)2981個(gè)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的區(qū)縣、37.88萬(wàn)個(gè)畜禽規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的污染普查,2017年畜禽養(yǎng)殖業(yè)的排放污染物中含氨氮11.09萬(wàn)t、總氮59.63萬(wàn)t、總磷11.97萬(wàn)t;其中,畜禽規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)排放污染物中含氨氮7.50萬(wàn)t,總氮37.00萬(wàn)t,總磷8.04萬(wàn)t.

當(dāng)水中富含氮、磷元素時(shí),會(huì)引起富營(yíng)養(yǎng)化;氮、磷元素在土壤中形成硝酸鹽和磷酸鹽類物質(zhì),長(zhǎng)時(shí)間的積累易破壞土壤結(jié)構(gòu),滲透進(jìn)地下水造成污染[2-3].抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中主要用于疾病治療或促進(jìn)生長(zhǎng),研究表明,我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)每年使用的抗生素量約占全世界總量的70%[4].但畜禽僅能吸收少量抗生素,大部分隨糞便排出體外,進(jìn)入水環(huán)境和土壤中,引起環(huán)境中細(xì)菌等微生物產(chǎn)生耐藥性,或被植物或水生生物吸收積累,或通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體體內(nèi),危害人類生命健康.因此,對(duì)于畜禽糞便中氮磷、抗生素的監(jiān)測(cè)具有重大研究意義[5].

目前,關(guān)于禽畜糞便中氮磷的檢測(cè)方法主要是參考我國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《有機(jī)肥料(NY525-2012)》[6]中總氮、總磷的實(shí)驗(yàn)室化學(xué)分析方法.實(shí)驗(yàn)室化學(xué)分析法由于靈敏度較低,且檢測(cè)需要使用化學(xué)試劑,不適合進(jìn)行原位、在線檢測(cè).近紅外光譜法相較于實(shí)驗(yàn)室化學(xué)分析方法具有綠色環(huán)保和可在線分析的特點(diǎn),但其目前主要用于評(píng)估預(yù)測(cè),準(zhǔn)確度仍有待提高[7].液相色譜法是抗生素的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法,對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)具有較好的分離效果,與不同檢測(cè)器聯(lián)用可達(dá)到準(zhǔn)確的定性定量分析;但色譜法需使用大型儀器設(shè)備,無(wú)法現(xiàn)場(chǎng)作業(yè)[8-9].隨著對(duì)快速、靈敏、可現(xiàn)場(chǎng)部署、可在線監(jiān)測(cè)和廉價(jià)傳感器的需求不斷增加,氮磷、抗生素的電化學(xué)、熒光檢測(cè)方法[10-13]近年來(lái)得到了廣泛關(guān)注和研究.相對(duì)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法,這類方法具有更低的檢測(cè)限、更短的檢測(cè)時(shí)間且操作便捷.作為前沿檢測(cè)方法,電化學(xué)法和熒光法已被廣泛應(yīng)用于各種介質(zhì)中的氮磷和抗生素檢測(cè),但其在糞便樣品分析中的應(yīng)用很少.對(duì)于糞便樣品分析,可通過(guò)前處理提取其中的氮磷和抗生素,再利用電化學(xué)法、熒光法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè).因此,電化學(xué)法、熒光法在糞便中氮磷、抗生素的快速分析中具有很大應(yīng)用潛力.

本文主要綜述了近年來(lái)糞便中氮磷和抗生素的檢測(cè)方法研究進(jìn)展,其中包括了氮磷和抗生素的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法和新型檢測(cè)方法,如近紅外光譜分析法、液相色譜法等.并對(duì)應(yīng)用于其他介質(zhì)中的電化學(xué)及熒光等氮磷和抗生素檢測(cè)方法進(jìn)行了介紹,評(píng)價(jià)了其在糞便檢測(cè)中的應(yīng)用潛力.

1 氮、磷檢測(cè)方法

糞便中氮磷的檢測(cè)主要包括實(shí)驗(yàn)室化學(xué)分析方法和近紅外光譜分析法.另外,電化學(xué)分析法也被用于氮磷檢測(cè),并在糞便樣品的氮磷檢測(cè)中展現(xiàn)了很大應(yīng)用潛力.

1.1 氮、磷的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法

目前對(duì)糞便中氮、磷的測(cè)定暫無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),主要是參考NY 525-2012標(biāo)準(zhǔn)[6]中有機(jī)肥料中總氮、總磷的檢測(cè)方法.NY 525-2012總氮的測(cè)定方法是基于凱氏定氮法,主要包括3個(gè)步驟:消解、蒸餾、滴定.通過(guò)濃硫酸—過(guò)氧化氫消解樣品,大多數(shù)有機(jī)含氮樣品經(jīng)消解轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮,然后將堿化后蒸餾出來(lái)的氨用硼酸溶液吸收,以標(biāo)準(zhǔn)酸溶液滴定[14].關(guān)于磷的測(cè)定,標(biāo)準(zhǔn)中的測(cè)定方法是鉬酸銨分光光度法.其原理是將有機(jī)含磷樣品經(jīng)過(guò)硫酸和過(guò)氧化氫消煮,在一定酸度下,待測(cè)液中的磷酸根離子與偏釩酸和鉬酸反應(yīng)形成黃色三元雜多酸.因在一定濃度范圍內(nèi),黃色溶液的吸光度與含磷量成正比例關(guān)系,可用分光光度法定量測(cè)定;其主要測(cè)定物為總磷.目前研究中,許多工作參考以上標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)區(qū)域養(yǎng)殖場(chǎng)的畜禽糞便氮磷含量進(jìn)行檢測(cè).如郭建鳳等[15]、黃紅衛(wèi)等[16]通過(guò)利用凱氏定氮法檢測(cè)了養(yǎng)殖場(chǎng)畜禽糞便中氮磷含量.凱氏定氮法雖能有效的檢測(cè)糞便中總氮含量,但其需要使用許多化學(xué)試劑,且前處理過(guò)程較為復(fù)雜,耗時(shí)長(zhǎng).

杜馬斯燃燒法是應(yīng)用較多的另一種總氮檢測(cè)法,其原理是:樣品在900~1200 ℃高溫下燃燒,產(chǎn)生混合氣體,其中的干擾物被吸收劑吸收,而氮氧化物被全部還原成分子氮,隨后被熱導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)[17].相對(duì)凱氏定氮法,其效率更高,每次測(cè)試只需幾分鐘;不使用化學(xué)試劑,綠色無(wú)害;其檢測(cè)的氮不僅包括有機(jī)氮還包括無(wú)機(jī)氮,如亞硝酸鹽及硝酸鹽類,測(cè)總氮時(shí)更精準(zhǔn)[18].沈秀麗等[19]的研究表明,杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法檢測(cè)蛋雞糞、肉雞糞、豬糞、奶牛糞和肉牛糞中氮含量的準(zhǔn)確性沒有顯著差異.

以上實(shí)驗(yàn)室化學(xué)分析主要還是以NY 525- 2012[6]中的檢測(cè)方法為主,這類方法雖然精度較高,但耗時(shí)費(fèi)力且無(wú)法進(jìn)行原位快速檢測(cè)或長(zhǎng)期監(jiān)測(cè).因此,近紅外光譜分析法作為一種高效、快速的氮磷檢測(cè)方法,近年來(lái)受到研究者的關(guān)注.

1.2 近紅外光譜分析法

基于耗時(shí)短、綠色環(huán)保、可在線分析及遠(yuǎn)程監(jiān)控的特點(diǎn),近紅外光譜分析技術(shù)(NIRS)在近幾年發(fā)展迅速.NIRS的原理是:在波長(zhǎng)為780~2526nm范圍,通過(guò)投射、漫反射的方式獲取樣品成分在近紅外區(qū)含氫鍵基團(tuán)化學(xué)鍵振動(dòng)產(chǎn)生的吸收光譜;其不同光譜區(qū)域信號(hào)體現(xiàn)不同物質(zhì)的信息,可根據(jù)光譜的形狀與位置分析待測(cè)物的化學(xué)結(jié)構(gòu),并通過(guò)吸收峰的強(qiáng)度確定待測(cè)成分含量[20].將NIRS分析技術(shù)與偏最小二乘回歸法(PLS)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法(ANN)等現(xiàn)代分析技術(shù)結(jié)合,建立光譜與待測(cè)物質(zhì)成分之間的線性或非線性模型,從而實(shí)現(xiàn)利用NIRS技術(shù)對(duì)糞便中成分的檢測(cè)[20-21].

Saeys等[22]通過(guò)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)分析法測(cè)出樣品中總氮、總磷的真實(shí)值,再利用NIRS評(píng)估豬糞中總氮、總磷含量,然后利用PLS法,對(duì)總氮、總磷的真實(shí)值與光譜之間的關(guān)系進(jìn)行分析,建立模型,并使用單次交叉驗(yàn)證技術(shù)進(jìn)行校準(zhǔn).利用2003年春季從不同的農(nóng)場(chǎng)收集的一組豬糞樣本驗(yàn)證了模型的準(zhǔn)確性.其評(píng)估2003年豬糞樣品總氮的相關(guān)系數(shù)(預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間的相關(guān)系數(shù)2)為0.86,相對(duì)分析誤差(RPD)為2.63(RPD主要用于衡量模型計(jì)算值的精準(zhǔn)度, 23表明計(jì)算值精準(zhǔn)度高).通過(guò)對(duì)2004年春季收集的一組豬糞樣本作為標(biāo)樣, Bastianelli等[23]也提出NIRS可以準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)畜禽糞便中的化學(xué)成分,其中總氮的2= 0.89,RPD為2.8.NIRS研究主要采用傳統(tǒng)的線性回歸方法建立畜禽糞便中養(yǎng)分含量與光譜信息之間的校正模型,如PLS.Chen等[24]提出了一種非線性方法,利用非線性校正模型ANN校正,評(píng)估家禽糞便中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),并將ANN與PLS方法進(jìn)行對(duì)比.結(jié)果表明,PLS法對(duì)氨氮、總氮、總磷的預(yù)測(cè)RPD為2.62, 2.75, 2.01,相關(guān)系數(shù)為0.88,0.88,0.80; ANN法對(duì)氨氮、總氮、總磷的預(yù)測(cè)RPD為3.02, 3.41,2.71,相關(guān)系數(shù)為0.90,0.92,0.86;即ANN法相較于PLS法更能準(zhǔn)確的評(píng)估畜禽糞便中的氮、磷含量.Tamburini等[25]在2015年報(bào)道了一種傅里葉變換近紅外(FT-NIR)光譜法,以確定不同類型家禽糞便中的總氮.該研究從意大利東北部的農(nóng)場(chǎng)獲得了涵蓋各種家禽類型和不同飼養(yǎng)條件的樣本,在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了校準(zhǔn)和驗(yàn)證;其校準(zhǔn)總氮的相關(guān)系數(shù)為0.94,驗(yàn)證的總氮相關(guān)系數(shù)為0.82,并將儀器放置在特殊車輛中可實(shí)現(xiàn)原位在線檢測(cè).

NIRS技術(shù)通過(guò)建立模型來(lái)檢測(cè)糞便中的氮磷等成分,耗時(shí)短,且不需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理過(guò)程,可實(shí)現(xiàn)多種成分同時(shí)檢測(cè)、在線分析和遠(yuǎn)程監(jiān)控,但也具有一定的缺陷.如模型的相關(guān)系數(shù)仍有待提高;不同地點(diǎn)、不同時(shí)間需要建立不同的模型,且需要不斷維護(hù)更新來(lái)確保其準(zhǔn)確性;構(gòu)建一個(gè)模型前,常需要大量的樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行支撐.

1.3 電化學(xué)分析法

電化學(xué)分析法具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于環(huán)境樣品中的氮、磷檢測(cè).但糞便是一種復(fù)雜基質(zhì),含有多種背景物質(zhì)(如無(wú)機(jī)物、有機(jī)物和生物物質(zhì)等),這些物質(zhì)的存在會(huì)影響電化學(xué)分析法的靈敏度和準(zhǔn)確性.因此,電化學(xué)分析法在糞便樣品的氮、磷檢測(cè)中應(yīng)用較少.將畜禽糞便樣品置于風(fēng)干盤中,剔除毛發(fā)、石塊等雜物,經(jīng)風(fēng)干、研磨,過(guò)篩,得到均勻樣品;再對(duì)樣品消解,提取其中的氮、磷等元素.如通過(guò)濃硫酸和過(guò)氧化氫消解樣品,可將糞便中的大多數(shù)有機(jī)含氮轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮;經(jīng)過(guò)硫酸和過(guò)氧化氫消煮,可將有機(jī)磷轉(zhuǎn)化成磷酸鹽[6];然后再結(jié)合電化學(xué)檢測(cè)方法,即可對(duì)糞便中氮、磷進(jìn)行分析檢測(cè).

電化學(xué)法是基于檢測(cè)物在電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的電流、電阻或電位的變化進(jìn)行檢測(cè),其核心是電極材料和探針的選擇,這決定著傳感器的穩(wěn)定性、靈敏度等.電化學(xué)法檢測(cè)環(huán)境中的氮,主要是檢測(cè)NH4+、NO3-、NO2-這3類含氮離子;其中NO3-、NO2-較容易氧化還原轉(zhuǎn)移電子,一般可采用直接檢測(cè)法,該類物質(zhì)檢測(cè)限大部分都已達(dá)到μmol/L甚至nmol/L級(jí)別.酶、離子載體、絡(luò)合基團(tuán)等都是檢測(cè)這類物質(zhì)常見的探針[27-29].另外,環(huán)糊精,噻唑苯并冠醚乙胺-硫辛酸等都曾被作為離子載體檢測(cè)NH4+.其中,基于環(huán)糊精的伏安法傳感器的檢測(cè)線性范圍是4.2~66.0μmol/L[30];而噻唑苯并冠醚乙胺-硫辛酸(TBCEAT)伏安法傳感器的檢測(cè)線性范圍是1~105μmol/L[31];納米銅-聚苯胺納米復(fù)合材料離子印跡聚合物(IIPs)化學(xué)傳感器[32]檢測(cè)NO3-的檢測(cè)限為5μmol/L.貴金屬、過(guò)渡金屬或過(guò)渡金屬氧化物因其具有較強(qiáng)的催化活性常被用作電極材料或修飾在電極上用于檢測(cè)含氮物質(zhì).有研究表明在鉑電極上修飾ZnO檢測(cè)NO3-的檢測(cè)限可達(dá)到0.018μmol/L[33]; Cu-Ni[34]和Cu-Pd[35]等作電極時(shí),檢測(cè)限可達(dá)到′10-6級(jí).具有較好的導(dǎo)電性及化學(xué)穩(wěn)定性的碳材料及具有良好電子特性的納米材料也被廣泛應(yīng)用于NO3-、NO2-檢測(cè),Chen等[26]構(gòu)建了基于還原氧化石墨烯(rGO)納米片的場(chǎng)效應(yīng)晶體管傳感器(圖1),使用芐基三乙基氯化銨(TEBAC)作為探針檢測(cè)NO3-,檢測(cè)限可達(dá)到0.02μmol/L,且檢測(cè)時(shí)間僅需2~7s.此外,也有研究將納米金屬(金納米顆粒/AuNPs、銀納米顆粒/AgNPs)[36-37]負(fù)載在石墨烯表面檢測(cè)NO2-. Zhao等[38]利用一種射線輻照法制備納米銀功能化石墨烯復(fù)合材料檢測(cè)NO2-,其檢測(cè)限為0.24μmol/L.

與硝酸鹽、亞硝酸鹽不同,磷酸鹽因很難被氧化,因此其電化學(xué)傳感檢測(cè)一般使用間接檢測(cè)法,即利用磷酸鹽的存在影響原體系氧化還原反應(yīng)中電子的轉(zhuǎn)移從而達(dá)到檢測(cè)目的.如有研究利用雙硫脲冠醚作為受體檢測(cè),通過(guò)H2PO4-與其結(jié)合影響亞鐵氰化鉀的氧化還原反應(yīng)中電子轉(zhuǎn)移,從而進(jìn)行檢測(cè),其檢測(cè)限為165μmol/L[39].Cinti等[40]利用鐵氰化鉀作為電子轉(zhuǎn)移中間體檢測(cè)磷酸鹽,其檢測(cè)限為4000μmol/L,線性范圍為4000~300000μmol/L.He等[41]利用一步水熱法合成納米級(jí)水合鎳氫氧化物電極檢測(cè)磷酸鹽,在電極靈敏度為210μA×L/ (mmol·cm2)時(shí),其檢測(cè)限為0.42μmol/L,線性范圍10~ 50000μmol/L,響應(yīng)時(shí)間為6s;在電極靈敏度為87μA×L/(mmol·cm2)時(shí),其檢測(cè)限為0.36μmol/L,線性范圍2~5650μmol/L,響應(yīng)時(shí)間為8s. Sun等[42]提出了一種通過(guò)無(wú)定形磷化鈣(CaP)相變時(shí)配位羥基的氧化直接檢測(cè)磷酸鹽的電化學(xué)方法.該方法在全氟聚合物涂層的玻碳電極上原位形成CaP和磷酸八鈣(Ca8(HPO4)2(PO4)4·5H2O)涂層.磷酸鹽離子作為質(zhì)子受體可以促使CaP中的配位水(H2O)生成配位羥基,另外由于Ca2+與H2O的水合作用,會(huì)增加配位H2O源.該電極在電壓為1.0V處產(chǎn)生明顯的氧化峰;該方法檢測(cè)限可達(dá)到0.053μmol/L,線性范圍為10~ 1000μmol/L.

圖1 場(chǎng)效應(yīng)晶體管傳感器結(jié)構(gòu)示意及其對(duì)NO3-離子的動(dòng)態(tài)響應(yīng)信號(hào)

NO3-濃度：0.0028mg/L、0.028mg/L、0.28mg/L、2.8mg/L、28mg/L

表1 氮、磷的檢測(cè)方法

續(xù)表1

注:RPD:相對(duì)分析誤差; RSD:相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差.“-”表示無(wú)此項(xiàng),下同.

表1為氮、磷檢測(cè)方法匯總.標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的前處理較為復(fù)雜,需要使用消解劑或提取劑,耗時(shí)長(zhǎng);NIRS樣品準(zhǔn)備簡(jiǎn)單,檢測(cè)速度快,可同時(shí)實(shí)現(xiàn)多成分檢測(cè),但其準(zhǔn)確度仍有待提高;電化學(xué)法相較于另外兩種檢測(cè)方法,檢測(cè)限低,可達(dá)到μmol/L級(jí)別,選擇性高,但無(wú)法實(shí)現(xiàn)多種物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)且構(gòu)建方法種類繁多,無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn).

2 抗生素檢測(cè)方法

畜禽糞便中抗生素類物質(zhì)的常規(guī)檢測(cè)方法主要是高效液相色譜法及液相色譜與其他檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用.電化學(xué)分析法和熒光檢測(cè)法由于其優(yōu)異的抗生素檢測(cè)能力,在畜禽糞便中抗生素類物質(zhì)的檢測(cè)中具有很大應(yīng)用潛力.

2.1 液相色譜法

液相色譜以液體為流動(dòng)相,具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相流入固定相的色譜柱,在柱內(nèi)各成分被分離后,進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析.高效液相色譜法是液相色譜法中的一種,主要是流動(dòng)相通過(guò)高壓泵輸入色譜柱,其對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)具有較好的分離效果,并能準(zhǔn)確的定性定量分析,因此被廣泛應(yīng)用于糞便中抗生素的檢測(cè).目前對(duì)于糞便中的抗生素檢測(cè)主要是依據(jù)《有機(jī)肥料中土霉素、四環(huán)素、金霉素與強(qiáng)力霉素的含量測(cè)定高效液相色譜法》(GB/T 32951-2016)[43],其檢測(cè)限分別為:土霉素750μg/kg、四環(huán)素750μg/kg、金霉素1000μg/kg、強(qiáng)力霉素750μg/kg.

利用液相色譜法檢測(cè)糞便中抗生素的殘留量,抗生素的提取是至關(guān)重要的步驟,提取劑和提取方法直接關(guān)系檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[44].喹諾酮類抗生素樣品預(yù)處理過(guò)程中,需將樣品pH值調(diào)節(jié)至酸性條件,因此提取劑一般使用弱酸性緩沖溶液.另外,喹諾酮類與四環(huán)素類抗生素易于與EDTA螯合,使抗生素從基質(zhì)中脫落,因此提取劑主要以EDTA-Mcllvaine緩沖液為主,其他還包括檸檬酸、乙酸等.夏天驕等[45]以EDTA-Mcllvaine緩沖液作為提取劑檢測(cè)豬糞樣品,回收率為89.7%~96.8%.

糞便中抗生素的提取方法主要包括加速溶劑萃取法、超聲萃取法以及震蕩提取法.常利用固相萃取法來(lái)凈化抗生素提取液,并以極性較大的甲醇或極性較小的二氯甲烷、乙酸乙酯作洗脫劑將抗生素從吸附柱上洗脫.李艷霞等[46]利用加速溶劑萃取法提取,并通過(guò)固相萃取凈化多種抗生素,回收率為58%~101%.羅慶等[47]利用固相萃取法-高效液相色譜檢測(cè)糞便中的羅紅霉素、土霉素、四環(huán)素、金霉素的殘留量,檢測(cè)限為60~380μg/kg.

此外,液相色譜法與質(zhì)譜法(LC-MS)[48-49]、熒光檢測(cè)法(LC-FLD)[50]或二極管列陣檢測(cè)法(LC- DAD)[51]聯(lián)用也是檢測(cè)糞便中抗生素應(yīng)用較多的方法.聯(lián)用技術(shù)相對(duì)于高效液相色譜法(HPLC),靈敏度更高.王麗等[48]利用HPLC-MS/MS檢測(cè)豬糞、雞糞中的四環(huán)素類、氟喹諾酮類和磺胺類抗生素,其檢測(cè)限分別為30.25~7.18, 0.15~3.16和0.04μg/kg.劉博等[52]利用HPLC-FLD檢測(cè)了北京5個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)中雞糞樣品中6種氟喹諾酮類抗生素,其檢出限為2~ 22μg/kg(表2).

表2 抗生素的液相色譜檢測(cè)法

注:TCs:四環(huán)素類;SAs:磺胺類;FQs:氟喹諾酮類;MAs:大環(huán)內(nèi)酯類;OTC:土霉素;TTC:四環(huán)素;CTC:金霉素.下同.

2.2 電化學(xué)分析法

電化學(xué)分析法被廣泛應(yīng)用于多種介質(zhì)中抗生素的檢測(cè),其相較液相色譜法及其聯(lián)用技術(shù)等大型儀器法更加便捷、簡(jiǎn)單.通過(guò)適當(dāng)?shù)奶崛⑻崛》椒▽?duì)樣品進(jìn)行處理,并利用固相萃取等方法凈化,便可獲取糞便中的目標(biāo)抗生素,從而利用電化學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)分析.

電化學(xué)法中常用的探針主要有酶、適配體以及分子印跡聚合物等.Gon?alves等[53]通過(guò)在電極上固定青霉素酶作為探針檢測(cè)青霉素G,檢測(cè)限為1.5μg/L.因?yàn)槊冈诟邷鼗蛩嵝詨A性等條件下容易失活,對(duì)環(huán)境條件要求較高,因此基于適配體的傳感器被廣泛研究.Li等[54]研究了一種基于適配體的絲網(wǎng)印刷碳電極多重電化學(xué)方法檢測(cè)卡那霉素(KAN)和鏈霉素(STR);其檢測(cè)原理是KAN和STR能夠特異性地與適配體結(jié)合,經(jīng)CdS和PbS標(biāo)記的適配體互補(bǔ)鏈被釋放,引起電極的電流變化;該方法對(duì)卡那霉素和鏈霉素的檢測(cè)限分別為0.042和0.026μg/L. Chen等[55]提出了基于適配體/還原氧化石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管傳感器,通過(guò)適配體與妥布霉素結(jié)合后發(fā)生構(gòu)型變化,改變晶體管中導(dǎo)電通道電阻而進(jìn)行檢測(cè),其檢測(cè)限為0.14μg/L,響應(yīng)時(shí)間約為5s.該課題組還構(gòu)建了基于互補(bǔ)鏈脫落原理的適配體/MoS2傳感器[56]來(lái)檢測(cè)KAN,其檢測(cè)限為0.32~ 0.51μg/L,且具有很高的檢測(cè)特異性和抗干擾性.適配體雖相較于酶具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性,但分子印跡探針?lè)€(wěn)定性更好,且其能更好的區(qū)分結(jié)構(gòu)類似的分子,選擇性更高. Jafari等[57]以苯胺為單體,阿奇霉素為模板構(gòu)建了基于分子印跡聚合物的電化學(xué)傳感器檢測(cè)阿奇霉素,該傳感器的線性檢測(cè)范圍為0.225~ 689μg/L,檢測(cè)限為0.075μg/L.Ayankojo等[58]提出了分子印跡聚合物絲網(wǎng)印刷電極檢測(cè)紅霉素,通過(guò)對(duì)間苯二胺(mPD)的化學(xué)聚合,直接在電極上制備了選擇性分子印跡聚合物,檢測(cè)限可達(dá)到0.073μg/L,且有較好的選擇性.

2.3 熒光檢測(cè)法

熒光檢測(cè)法的基本原理是檢測(cè)物與探針結(jié)合后引起熒光信號(hào)的減弱或增強(qiáng),通過(guò)熒光信號(hào)的變化進(jìn)行分析檢測(cè),其具有較高的選擇性和較低的檢測(cè)限,目前被廣泛應(yīng)用于抗生素分析.根據(jù)與抗生素結(jié)合的探針類型,熒光法主要可以分為分子印跡型和適配體型[59-60].Yuphintharakun等[61]報(bào)道了一種含有羧基化多壁碳納米管(COOH@MWCNT)和量子點(diǎn)(QDs)的分子印跡聚合物熒光傳感器,其檢測(cè)限為0.066μg/L.此外,作者利用乙腈/三羥甲基氨基甲烷緩沖液作為提取劑,經(jīng)過(guò)攪拌、離心得到雞肉和牛奶中的環(huán)丙沙星提取液,并利用該傳感器檢測(cè),回收率為82.6%~98.4%.其中,羧酸功能化的多壁碳納米管可通過(guò)π-π作用提高環(huán)丙沙星的動(dòng)力學(xué)吸附和結(jié)合力;而分子印跡聚合物可提高傳感器對(duì)環(huán)丙沙星的選擇性.其工作原理是環(huán)丙沙星與分子印跡中功能單體氨基之間可形成氫鍵,導(dǎo)致QDs導(dǎo)帶電子轉(zhuǎn)移到環(huán)丙沙星最低未占據(jù)分子軌道,引起熒光猝滅. Wang等[62]提出了基于分子印跡熒光傳感檢測(cè)四環(huán)素的方法,其利用丙烯基熒光素功能化的二氧化硅微球與分子印跡聚合物形成復(fù)合材料,該方法的檢測(cè)限低至1.9μg/L.

除分子印跡型外,適配體型熒光傳感器在抗生素的檢測(cè)中也得到了廣泛研究.Zhao等[63]研究了基于組裝在還原氧化石墨烯上的適配體熒光傳感器以檢測(cè)土霉素.土霉素使帶有熒光素的適配體從石墨烯上脫落,導(dǎo)致熒光信號(hào)變化,其線性檢測(cè)范圍為46~920μg/L,檢測(cè)限為0.46μg/L.Ramezani等[64]提出了基于外切酶III(Exo III)和金納米顆粒的卡那霉素?zé)晒鈧鞲衅?其最大特點(diǎn)是利用Exo III對(duì)適配體進(jìn)行催化回收,以最小的適配體消耗來(lái)增強(qiáng)熒光強(qiáng)度,其檢測(cè)限為0.155μg/L.

表3為抗生素的檢測(cè)方法匯總,主要包括液相色譜法、電化學(xué)法和熒光法.液相色譜法是傳統(tǒng)的抗生素檢測(cè)方法,其對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)具有較好的分離效果,且可同時(shí)檢測(cè)多種物質(zhì),但一般需大型設(shè)備,便捷性較差.電化學(xué)法和熒光法操作簡(jiǎn)單、選擇性強(qiáng),且檢測(cè)限低,但這類方法抗干擾性較弱,且難以實(shí)現(xiàn)多種抗生素的同時(shí)檢測(cè).

表3 抗生素的檢測(cè)方法

3 結(jié)論與展望

3.1 糞便樣品的常規(guī)檢測(cè)方法具有準(zhǔn)確度高、靈敏度好的特點(diǎn),但大部分都需要在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行或需要使用大型儀器,難以滿足原位快速檢測(cè)或在線監(jiān)測(cè)的需要,因此需要研究糞便中氮磷、抗生素檢測(cè)的新技術(shù).

3.2 糞便中的氮磷、抗生素等成分可通過(guò)前處理方法提取出來(lái),再結(jié)合簡(jiǎn)單、便捷的電化學(xué)法、熒光法等對(duì)其進(jìn)行檢測(cè).目前電化學(xué)法、熒光法等檢測(cè)技術(shù)在其他環(huán)境樣品中的研究較多,但對(duì)糞便樣品的檢測(cè)分析應(yīng)用較少;因此,電化學(xué)法、熒光法在糞便中氮磷、抗生素的快速分析中具有很大應(yīng)用潛力.電化學(xué)法、熒光法的抗干擾性、可重復(fù)性以及實(shí)現(xiàn)多種物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)是在糞便分析應(yīng)用中的研究重點(diǎn).

3.3 糞便中污染物的高效檢測(cè)技術(shù)在未來(lái)的發(fā)展空間和需求較大,而將電化學(xué)法、熒光法應(yīng)用于糞便中氮磷、抗生素的檢測(cè)需要持續(xù)深入的基礎(chǔ)研究和技術(shù)創(chuàng)新.

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Research advances in highly-efficient detection methods for nitrogen, phosphorus and antibiotics in livestock and poultry manure.

HAO Si-bei, LIU Cheng-bin, CHEN Xiao-yan, MAO Shun*

(State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China)., 2021,41(4)：1746~1755

In this article, conventional detection methods and emerging detection techniques for nitrogen, phosphorus, and antibiotics in feces have been systematically reviewed to identify the bottlenecks and future research directions. For the conventionalfeces detection methods, they are of high accuracy and sensitivity, but often carried out in professional laboratories or require the use of large instruments. It is quite challenging to meet the need of rapid detection in in-situ or online monitoring situations. Therefore, new detection technologies for nitrogen, phosphorus, and antibiotics in feces are highly needed. Nitrogen, phosphorus, and antibiotics in feces can be extracted by pretreatment, and then be analyzed with simple and convenient electrochemical or fluorescence methods to achieve rapid measures in in-situ analysis or online monitoring settings. Given current technologies, highly efficient detection technologies for pollutants in feces have great potentials and demand in the future. The applications of electrochemical and fluorescence methods in nitrogen, phosphorus, and antibiotics detection in feces need continuous support in fundamental research and technological innovations.

livestock and poultry manure；nitrogen；phosphorus；antibiotic；highly-efficient detection method

X713;O657

A

1000-6923(2021)04-1746-10

郝斯貝(1997-),女,湖南株洲人,同濟(jì)大學(xué)碩士研究生,研究方向?yàn)榄h(huán)境分析與傳感檢測(cè)技術(shù).發(fā)表論文3篇.

2020-08-31

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2018YFC1903201)

* 責(zé)任作者, 教授, shunmao@tongji.edu.cn