基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討貓爪草治療肺癌的作用機(jī)制

黃重銘，彭慧婷，林曉彤，曹洋

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405）

在全球范圍內(nèi)，肺癌仍是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。肺癌的主要臨床表現(xiàn)為咳嗽、血痰、胸悶胸痛、氣促、發(fā)熱等[2]。由于癥狀缺乏特異性，常與呼吸系統(tǒng)的癥狀相似，患者多不重視，因此確診時(shí)往往已失去根治性手術(shù)切除的機(jī)會(huì)[3]。目前肺癌的治療以手術(shù)、放化療、靶向治療、免疫治療為主，可并發(fā)骨髓抑制、神經(jīng)毒性、肝腎功能損害、皮疹、間質(zhì)性肺炎等不良反應(yīng)，整體治療效果仍不理想[2,4]。隨著研究的不斷深入，中醫(yī)藥在治療肺癌方面逐漸顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。研究表明，中醫(yī)藥在抑制肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移，改善放化療及靶向治療的毒副作用，提高患者的生存質(zhì)量，延長生存期等方面發(fā)揮重要作用[5]。

貓爪草是毛茛科植物小毛茛（Ranunculus ternatusThunb.）的干燥塊根，廣泛分布于河南、安徽、浙江、江蘇等地。貓爪草的藥用歷史較短，最早收錄于《中藥材手冊(cè)》，1977 年起正式載入《中華人民共和國藥典》[6]。其味甘、辛，性溫，歸肝、肺經(jīng)，具有化痰消腫、解毒散結(jié)的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，貓爪草具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫活性、抗氧化、抗感染等藥理作用[7]，是治療肺癌的常用藥物之一。李穗暉[8]等采用仙魚湯（由仙鶴草、魚腥草、貓爪草、山海螺、天冬、山慈菇、浙貝母、萊菔子、守宮、枳殼、黨參等組成）治療中晚期原發(fā)性支氣管肺癌，結(jié)果顯示治療后免疫功能改善。申剛磊[9]等通過電子病歷系統(tǒng)提取和分析某三甲中醫(yī)院1 175 張治療肺癌的有效處方，中藥頻次統(tǒng)計(jì)提示貓爪草是排名前10的高頻藥物。但由于中藥治療腫瘤具有“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的特點(diǎn)，貓爪草治療肺癌的作用機(jī)制尚不明確。

近年興起的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，綜合藥物、靶點(diǎn)與疾病之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，用于分析和預(yù)測藥物的作用機(jī)制[10-11]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選貓爪草治療肺癌的活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)，并對(duì)貓爪草治療肺癌的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測和分析，既為貓爪草的臨床應(yīng)用提供一定理論依據(jù)，也為對(duì)其更深入的研究提供思路和借鑒。

1 材料與方法

1.1 貓爪草活性成分的篩選

采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索并收集貓爪草的化學(xué)成分。選取符合篩選條件OB≥30%，DL≥0.18 的化學(xué)成分作為潛在活性成分。查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，收集具有抗癌活性但因不符合篩選條件而被刪除的化學(xué)成分。

1.2 貓爪草活性成分作用靶點(diǎn)的收集

將“1.1”項(xiàng)下篩選獲得的貓爪草潛在活性成分，通過Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索其化學(xué)結(jié)構(gòu)，并保存為Smiles 格式。將上述文件分別導(dǎo)入Swiss target prediction 平臺(tái)（http://swisstargetprediction.ch/），獲取活性成分作用靶點(diǎn)及靶點(diǎn)類型歸屬。

1.3 疾病靶點(diǎn)的收集與“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使 用DisGeNET 數(shù) 據(jù) 庫（http://www.disgenet.org/）和OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）收集肺癌相關(guān)靶點(diǎn)并去重合并。使用uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）分別對(duì)藥物潛在活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。利用Draw venn diagram（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）對(duì)活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行匹配映射，獲取共同靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。采用Cytoscape3.7.0 構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，分析活性成分和靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并篩選潛在關(guān)鍵活性成分。

1.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），限定研究物種為人類，將最低相互作用分值設(shè)置為“higest confident 0.9”，獲取高置信度的PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.0 進(jìn)行可視化與網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?。自由度（degree）反映網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點(diǎn)直接相互作用的節(jié)點(diǎn)的數(shù)目。自由度越高，節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。根據(jù)自由度對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行篩選。

1.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中查詢“1.3”項(xiàng)下篩選獲得的關(guān)鍵活性成分，并保存為mol2格式。使用Openbabel 2.4.1 將活性成分的靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為sdf 格式。在PDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）中查詢并下載核心靶點(diǎn)的3D 結(jié)構(gòu)。使用AutoDockTools 對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行加氫、去水等預(yù)處理。運(yùn)行AutoDockTools 對(duì)活性成分和靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行對(duì)接，以最低結(jié)合能作為分子對(duì)接的結(jié)果。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，結(jié)合能＜0 提示活性成分與靶點(diǎn)蛋白能發(fā)生自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能≤5 提示有較強(qiáng)的結(jié)合能力[12]。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）是一個(gè)集成生物知識(shí)庫和分析工具的數(shù)據(jù)庫，能夠系統(tǒng)地從給定的基因或蛋白質(zhì)列表中分析生物學(xué)意義[13]。將共同靶點(diǎn)上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫，GO 分析時(shí)選擇生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）3 個(gè)模塊進(jìn)行功能注釋，通路分析選擇KEGG 模塊。將分析結(jié)果分別編排至Excel 文件中，以P＜0.01 對(duì)結(jié)果進(jìn)行篩選并按照顯著程度由高到低排序。使用Omic-Share 平臺(tái)（https://www.omicshare.com/）將排名前20的KEGG分析結(jié)果以氣泡圖的形式展現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 貓爪草的活性成分

通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫，共收集到貓爪草的化學(xué)成分79 種。按OB≥30%、DL≥0.18 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步篩選，得到貓爪草潛在活性成分12種。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸（palmitic acid）的OB 值和DL 值雖然不滿足篩選條件，但已被證實(shí)具有較好抗癌活性，是貓爪草抗腫瘤的主要化學(xué)成分之一，因此將該化學(xué)成分也納入其中，最終獲得貓爪草潛在活性成分13種，見表1。

2.2 靶點(diǎn)收集與基因映射

通過Swiss target prediction 平臺(tái)對(duì)貓爪草潛在活性成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，共得到預(yù)測靶點(diǎn)294個(gè)，并通過Uniprot 標(biāo)準(zhǔn)化。使用DisGeNET 數(shù)據(jù)庫和OMIM（https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫收集肺癌相關(guān)靶點(diǎn)，分別獲得肺癌相關(guān)靶點(diǎn)2 449 個(gè)和200 個(gè)，去重合并后導(dǎo)入uniprot 標(biāo)準(zhǔn)化，最終獲取肺癌靶點(diǎn)2 303個(gè)。將貓爪草294個(gè)活性成分靶點(diǎn)和2 303個(gè)肺癌靶點(diǎn)進(jìn)行匹配映射并繪制韋恩圖，見圖1。獲取共同靶點(diǎn)121 個(gè)，這些靶點(diǎn)是貓爪草活性成分治療肺癌的潛在靶點(diǎn)。

2.3 “活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將匹配映射獲得的121個(gè)潛在靶點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)的活性成分信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.0，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見圖2。圖2 表明，存在多種成分對(duì)應(yīng)1 個(gè)靶點(diǎn)或1 種成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)的現(xiàn)象，體現(xiàn)中藥多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)[14]。網(wǎng)絡(luò)與共同靶點(diǎn)直接相連的貓爪草活性成分有8 種，提示這些化學(xué)活性成分具有潛在治療肺癌作用。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示，能同時(shí)與30個(gè)及以上靶點(diǎn)相連的活性成分（degree 值≥30）有3 種，包括7-O-甲基毛綱草酚（7-O-methyleriodictyol）（degree=50），鄰苯二甲酸正辛酯（truflex OBP）（degree=44）和棕櫚酸（palmitic acid）（degree=30），可能是貓爪草治療肺癌的關(guān)鍵活性成分。

表1 貓爪草活性成分Table 1 Active components of Ranunculi Ternati Radix

圖1 貓爪草活性成分作用靶點(diǎn)與肺癌相關(guān)靶點(diǎn)交集映射圖Figure 1 Intersection map of targets of active components of Ranunculi Ternati Radix and lung cancer related targets

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

通過String 數(shù)據(jù)庫得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并使用Cytoscape3.7.0 對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，見圖3。圖中共包含90 個(gè)節(jié)點(diǎn)，277 條連線。以節(jié)點(diǎn)的大小和顏色的深淺反映degree 值的大小。節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深，對(duì)應(yīng)的degree值越大，則該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的地位越重要。經(jīng)計(jì)算得網(wǎng)絡(luò)平均degree 值為6.16，以大于平均degree 值的2 倍為條件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行二次篩選[15]，最終獲得7 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，見表2。這些關(guān)鍵靶點(diǎn)可能在貓爪草治療肺癌中發(fā)揮重要作用，其蛋白類型以激酶為主。

2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

將篩選得到的7 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與3 種關(guān)鍵活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，見表3。由表3 可知，每1 個(gè)靶點(diǎn)蛋白至少可與1種關(guān)鍵活性成分較好結(jié)合，3種活性成分均能與大部分關(guān)鍵靶點(diǎn)較好結(jié)合。結(jié)果表明，貓爪草的活性成分可以對(duì)核心靶點(diǎn)發(fā)揮調(diào)控作用。

2.6 GO功能富集分析

GO 分析獲得P＜0.01 的條目共56 條，其中生物過程（BP）相關(guān)條目33 條，主要涉及轉(zhuǎn)錄、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、ERK1 和ERK2 級(jí)聯(lián)的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖調(diào)控、細(xì)胞周期阻滯的負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)自磷酸化等方面；細(xì)胞組分（CC）相關(guān)條目9 條，主要富集在細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物、細(xì)胞表面、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、胞漿等。分子功能（MF）相關(guān)條目14 條，主要富集在類固醇激素受體、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、配體激活序列特異性DNA 結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、藥物結(jié)合等。按照顯著程度排列對(duì)生物過程、細(xì)胞組分、分子功能的部分條目信息進(jìn)行展示，見表4。

2.7 KEGG通路富集分析

圖2 貓爪草活性成分和交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的構(gòu)建Figure 2 Construction of network relationship between active components of Ranunculi Ternati Radix and intersection targets

圖3 貓爪草治療肺癌相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 PPI network of related targets in the treatment of lung cancer with Ranunculi Ternati Radix

根據(jù)P＜0.01 共篩選出62 條KEGG 通路。按照顯著程度選取排名前20位的通路進(jìn)行分析，并通過Omicshare 平臺(tái)進(jìn)行可視化，見圖4。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，推測貓爪草活性成分靶點(diǎn)可能通過作用于缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、抑癌基因p53 信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號(hào)通路這4條通路發(fā)揮治療肺癌的作用。由于PI3K-Akt 通路是HIF-1、p53、VEGF 等通路的上游信號(hào)通路，且PI3K-Akt 通路富集了較多的貓爪草作用靶點(diǎn)，因此推測PI3K-Akt 信號(hào)通路是貓爪草治療肺癌的關(guān)鍵通路。見圖5。

3 討論

本研究共收集貓爪草相關(guān)活性成分共13 種。研究表明，棕櫚酸是貓爪草抗腫瘤的主要活性成分之一，能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制人肺癌A549 細(xì)胞株的增殖。藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，棕櫚酸靜脈注射后具有明顯的肺組織靶向性，在肺組織的濃度顯著高于其他組織中的藥物濃度[16]。此外，7-O-甲基毛綱草酚和鄰苯二甲酸正辛酯在“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中同屬于關(guān)鍵活性成分，但目前相關(guān)研究較少，可為抗癌中藥單體的研發(fā)提供新線索和研究方向。

肺癌的發(fā)生與多種驅(qū)動(dòng)基因密切相關(guān)，這些驅(qū)動(dòng)基因同時(shí)也是藥物作用的靶點(diǎn)[2]。表皮生長因子受體（EGFR）和磷脂酰肌醇-3-激酶（PIK3CA）是PPI網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。EGFR 是肺腺癌常見驅(qū)動(dòng)基因，其突變可導(dǎo)致酪氨酸激酶異常持續(xù)活化，造成細(xì)胞不受控生長而發(fā)生癌變，目前表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）治療EGFR 敏感突變已經(jīng)取得良好的效果[17]。分子對(duì)接結(jié)果表明，EGFR與貓爪草多種關(guān)鍵成分有較好的結(jié)合活性。貓爪草能否在EGFR-TKIs 靶向治療中起協(xié)同增效作用、能否對(duì)EGFR 的表達(dá)與突變起一定的抑制作用，進(jìn)而抑制肺癌的進(jìn)展，值得進(jìn)一步研究。PIK3CA 作為肺鱗癌較常見的驅(qū)動(dòng)基因[18]，其擴(kuò)增可以激活PI3K-AKT 信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力[19-20]，由于PIK3CA 激活突變對(duì)PI3K通路抑制劑最為敏感，因此PIK3CA 有望成為肺鱗癌治療的新靶點(diǎn)[18]。

表2 貓爪草治療肺癌關(guān)鍵靶點(diǎn)信息Table 2 Key target information of Ranunculi Ternati Radix in the treatment of lung cancer

表3 貓爪草關(guān)鍵靶點(diǎn)與關(guān)鍵活性成分的分子對(duì)接結(jié)果Table 3 Molecular docking results of Ranunculi Ternati Radix′s key targets and key active components

表4 GO功能富集分析結(jié)果Table 4 Results of GO functional enrichment analysis

圖4 KEGG功能富集分析結(jié)果（前20）Figure 4 Results of KEGG functional enrichment analysis（top 20）

圖5 貓爪草活性成分在PI3K-Akt信號(hào)通路的標(biāo)注圖Figure 5 Annotated drawing of the active components of Ranunculi Ternati Radix in the PI3K-Akt signaling pathway

GO 分析發(fā)現(xiàn)貓爪草作用靶點(diǎn)參與轉(zhuǎn)錄、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖調(diào)控、細(xì)胞周期阻滯的負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)自磷酸化等多種生物學(xué)過程，這些過程均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[21]。KEGG 分析表明，PI3K/AKT 通路是貓爪草治療肺癌的關(guān)鍵通路，是促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖、抗凋亡、促血管生成、化療耐受的重要途徑[22]。研究表明，PI3K/AKT 通路可通過促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤新生血管生成，進(jìn)而促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移[23-25]；還可下調(diào)p53 的表達(dá)，進(jìn)而阻斷凋亡信號(hào)通路的傳遞，誘導(dǎo)肺癌耐藥[22]。結(jié)合圖5可見，貓爪草作用靶點(diǎn)廣泛分布在PI3K/AKT 通路的上游、核心和下游等部分，因此推測貓爪草可以通過調(diào)控PI3K/AKT通路的相關(guān)靶點(diǎn)，發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)貓爪草治療肺癌作用機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)貓爪草可能通過抑制以PI3K-Akt 信號(hào)通路為主的多條肺癌相關(guān)途徑，發(fā)揮抑制增殖、促進(jìn)凋亡、抑制血管生成等作用。貓爪草治療肺癌的作用機(jī)制符合中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，后續(xù)研究將進(jìn)一步對(duì)篩選出來的關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從分子生物學(xué)層面明確貓爪草抑制肺癌的調(diào)控機(jī)制，為貓爪草的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。