基于UPLC特征圖譜的不同基原車前草差異成分研究

鐘春琳，曹斯瓊，孫冬梅，程學(xué)仁，潘禮業(yè)，葉瑞蓮，周湘媛，李國(guó)衛(wèi)

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東佛山528244）

車前草為車前科植物車前Plantago asiaticaL.或平車前Plantago depressaWilld.的干燥全草，夏季采挖，除去泥沙，曬干，具有清熱利尿通淋、祛痰、涼血、解毒的功效[1]。車前的性狀是根叢生，須狀；葉基生，具長(zhǎng)柄，葉片皺縮，展平后呈卵狀楠圓形或?qū)捖研危呙黠@弧形脈5～7 條；先端鈍或短尖，基部寬楔形，全緣或有不規(guī)則波狀淺齒。平車前的性狀是主根直而長(zhǎng)。葉片較狹，長(zhǎng)橢圓形或橢圓狀披針形。車前草主要有黃酮類、苯乙酰咖啡酰糖酯類、環(huán)烯醚萜類、三萜類化學(xué)成分，并具有抗感染、抗菌、抗?jié)儭⒖寡趸人幚碜饔肹2]。臨床應(yīng)用于流行性腮腺炎、慢性移動(dòng)性肝炎、褥瘡、壓瘡、產(chǎn)后尿潴留、隱匿性腎炎等病癥的治療[3-10]。

目前，針對(duì)車前草基原鑒別方法主要有性狀鑒別、顯微鑒別和應(yīng)用ITS2 序列鑒別[11-13]。2020 年版《中國(guó)藥典》一部主要以大車前苷的含量控制車前草藥材的質(zhì)量。由于車前與平車前基原不同，二者的化學(xué)成分組成及含量存在較大差異，僅靠單一的大車前苷含量難以真正評(píng)價(jià)其質(zhì)量，且不同基原車前草植物形態(tài)和藥材特征比較相似，藥材采收加工后葉片皺縮破裂，僅靠藥典含量測(cè)定方法無(wú)法準(zhǔn)確鑒別。本研究采用UPLC 法建立車前草藥材的特征圖譜和大車前苷、木犀草苷、車前草苷D和毛蕊花糖苷等4種指標(biāo)成分定量測(cè)定分析方法，能快速、準(zhǔn)確地鑒別車前與平車前，可綜合控制和評(píng)價(jià)二種基原車前草藥材的質(zhì)量。

1 儀器與材料

Waters H-Class 型超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；Agilent ZORBAX SB C18（100 mm×2.1 mm,1.8 μm）色譜柱；Mettler XP-26 百萬(wàn)分之一天平、ME204E 萬(wàn)分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q 超純水凈化系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純；水為Mili-Q 超純水；其余試劑為分析純。

大車前苷（批號(hào)：111914-201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：90.2%）、木犀草苷（批號(hào)：111720-201609，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：93.5%）、毛蕊花糖苷（批號(hào)：111530-201914，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：95.2%）對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；車前草苷D（批號(hào)：147331-98-4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.0%）對(duì)照品由上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司提供；實(shí)驗(yàn)所用藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定，S1～S14 號(hào)樣品為車前PlantagoasiaticaL.，S15～S25 號(hào) 樣 品 為 平 車 前Plantago depressaWilld.。藥材具體信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent ZORBAX SB C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱，流速為0.3 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為1 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm；以乙腈（A）-0.05%磷酸（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～5 min，12%→13%A；5～15 min，13%→17%A；15～20 min，17%A；20～25 min，17%→88%A；25～26 min，88%→12%A；26～35 min，12%A）。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取大車前苷、木犀草苷、車前草苷D、毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加60%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇制成質(zhì)量濃度分別為402.653 0、51.359 9、32.104 8、512.652 0 μg/mL 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、4、6、8 mL，置于10 mL量瓶中，用60%甲醇定容，濾過(guò)，得到系列濃度的混合對(duì)照品溶液。

表1 藥材詳情信息表Table 1 Information of samples

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（過(guò)二號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，用60%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 特征圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液（S1），按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以大車前苷為參照峰，計(jì)算7 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值均＜2%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（S1），按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定，以大車前苷為參照峰，計(jì)算7 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD 值均＜2%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品粉末約1.0 g（S1），平行6份，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，以大車前苷為參照峰，計(jì)算7個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD 值均＜2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 特征圖譜分析及評(píng)價(jià)

2.4.4.1 共有峰的確認(rèn) 取25 批車前草樣品，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.0 版本)”對(duì)25 批藥材樣品UPLC 特征圖譜進(jìn)行結(jié)果分析，分別對(duì)14 批車前和11 批平車前進(jìn)行共有峰標(biāo)識(shí)，分別以S1 和S15 號(hào)圖譜作為參照?qǐng)D譜，以“平均數(shù)”法作為對(duì)照?qǐng)D譜生成方式，全峰匹配分別生成14批車前和11 批平車前的特征圖譜，共標(biāo)定了12 個(gè)共有峰，同時(shí)分別生成對(duì)照?qǐng)D譜R1 和R2，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖2。通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出其中4個(gè)主要成分，分別為峰6（大車前苷）、峰7（木犀草苷）、峰8（毛蕊花糖苷）和峰9（車前草苷D），結(jié)果見(jiàn)圖3。選擇2020 年版《中國(guó)藥典》收載的車前草含量指標(biāo)成分峰6（大車前苷）為參照峰，各色譜峰相對(duì)峰面積結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.4.2 相似度評(píng)價(jià)結(jié)果 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.0版本）”分別對(duì)S1～S25共25批車前草藥材樣品UPLC 特征圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用平均數(shù)，時(shí)間窗口為1，自動(dòng)匹配，計(jì)算相似度系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。可見(jiàn)，14批車前藥材的相似度均在0.955～1.000之間，11批平車前藥材的相似度均在0.992～1.000 之間，同一基原樣品相似度高，相似度結(jié)果說(shuō)明同種基原的車前草藥材化學(xué)成分具有較好的一致性。分別把車前和平車前生成的對(duì)照?qǐng)D譜導(dǎo)入軟件，兩者的相似度值為0.441，說(shuō)明兩個(gè)基原藥材化學(xué)成分差異性較大。

2.4.5 聚類分類 運(yùn)用SPSS 22.0 軟件對(duì)25 批藥材樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以余弦距離作為樣品相似度的距離公式，樣品聚為兩類（見(jiàn)圖4）。S1～S14 為車前聚為Ⅰ類，S15～S25 為平車前聚為Ⅱ類，表明不同基原的藥材樣品具有顯著差異性。

圖1 14批車前藥材UPLC特征圖譜共有峰Figure 1 Common peaks of UPLC characteristic maps of 14 batches of Plantago asiatica L.

圖2 11批平車前藥材UPLC特征圖譜共有峰Figure 2 Common peaks of UPLC characteristic maps of 11 batches of Plantago depressa Willd.

圖3 對(duì)照品、供試品的UPLC圖Figure 3 UPLC charts of reference substance and sample

2.4.6 主成分分析 以25 批藥材樣品特征圖譜的12 個(gè)共有峰峰面積作為變量導(dǎo)入SPSS 22.0 軟件進(jìn)行主成分分析，提取2個(gè)特征值大于1的主成分。前2 個(gè)成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)值為87.105%，結(jié)果見(jiàn)表4。從表5可見(jiàn)，在第1主成分有較高載荷的包括峰1～6、峰8～11；在第2 主成分有較高載荷的包括峰7（載荷值＞0.80）。以降維得到的2 個(gè)主成分得分作為X、Y軸，得到25 個(gè)樣品的散點(diǎn)分布圖（見(jiàn)圖5），結(jié)果顯示，兩種基原藥材樣品能實(shí)現(xiàn)較好區(qū)分，同基原樣品能聚在同一區(qū)域，25 批車前草樣品分為2 類，即S1～S14號(hào)樣品為Ⅰ類，S15～25號(hào)樣品為Ⅱ類。從表6 可見(jiàn)，車前基原的藥材主成分1 得分均為正值，平車前基原的藥材主成分1 得分均為負(fù)值，主成分1為區(qū)分兩基原的主要因素。

2.5 質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

基于上述研究結(jié)果，為了區(qū)分車前與平車前藥材之間的差異。對(duì)已進(jìn)行歸屬的4個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行含量測(cè)定，進(jìn)一步評(píng)價(jià)車前草藥材的質(zhì)量。

表2 25批車前草藥材特征圖譜的相對(duì)峰面積Table 2 The relative peak area of the characteristic map of 25 batches of Plantaginis Herba

表3 不同基原車前草藥材樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 3 Evaluation results of the similarity of different bases of Plantaginis Herba

圖4 25批車前草藥材樣品聚類分析結(jié)果Figure 4 Cluster analysis results of 25 batches of Plantaginis Herba

2.5.1 檢測(cè)限和定量限考察 取混合對(duì)照品溶液，以60%甲醇等比例稀釋后，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，以信噪比3:1、10:1分別確定檢測(cè)限和定量限。結(jié)果得到大車前苷、木犀草苷、車前草苷D 和毛蕊花糖苷的檢測(cè)限分別是0.23、0.03、0.01、0.29 ng，定量限分別是0.79、0.10、0.04、0.99 ng。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液，加60%甲醇稀釋制得5 個(gè)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（y），質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到各個(gè)對(duì)照品的線性關(guān)系良好，結(jié)果見(jiàn)表7。

表4 特征峰、各主成分的貢獻(xiàn)率Table 4 Contribution rate of characteristic peaks and principal components

表5 各因子初始因子載荷矩陣Table 5 Initial factor load matrix of each factor

圖5 25批藥材樣品主成分得分分布圖Table 5 Diagram of principal component score of 25 batches of samples

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品粉末約1.0 g（S1），平行6份，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)條件測(cè)定，計(jì)算得到大車前苷、木犀草苷、車前草苷D 和毛蕊花糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 值均＜2%，表明方法重復(fù)性良好。

表6 25批車前草藥材主成分得分Table 6 Principal component score of 25 batches of Plantaginis Herba

2.5.4 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知成分含量的車前草供試品粉末（S1）6 份，每份約1.0 g，分別精密加入一定量的對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到大車前苷、木犀草苷、車前草苷D和毛蕊花糖苷的平均加樣回收率分別為94.29%、94.45%、96.38%、87.23%，RSD分別為1.30%、2.07%、1.68%、1.92%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.5.5 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定 取25批樣品，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)結(jié)果見(jiàn)表8。可見(jiàn)，大車前苷和木犀草苷為車前和平車前共有成分，車前的大車前苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于平車前，分別為0.18%、0.01%；兩個(gè)基原樣品木犀草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較小，均值分別為0.15%、0.17%，且兩組樣本質(zhì)量分?jǐn)?shù)互有高低；車前草苷D可在車前基原樣品檢出，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%；毛蕊花糖苷可在平車前基原樣品檢出，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.48%。

3 討論

本研究對(duì)比甲醇、30%甲醇、60%甲醇、60%乙醇和乙醇5 種提取溶劑對(duì)車前草藥材的提取效果，發(fā)現(xiàn)60%甲醇提取效果最好，乙醇提取的效果最差，因此選用60%甲醇作為提取溶劑；同時(shí)對(duì)超聲和加熱回流2 種提取方式進(jìn)行考察，結(jié)果加熱回流提取方式峰面積/稱樣量的值更大，因此選用加熱回流提取方式。

本研究建立了同時(shí)測(cè)定不同基原車前草藥材UPLC 特征圖譜及4個(gè)特征性成分含量的方法，并采用聚類分析和主成分分析對(duì)不同基原的25 批車前草樣本進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示車前和平車前有著顯著性的差異，大車前苷和木犀草苷為車前和平車前共有成分，車前的大車前苷含量明顯高于平車前，兩個(gè)基原樣品木犀草苷含量差異較小；而車前草苷D 成分只在車前中檢出，毛蕊花糖苷成分只在平車前中檢出；相似度評(píng)價(jià)結(jié)果則顯示，14 批車前的相似度均大于0.955，11 批平車前的相似度均大于0.992，說(shuō)明不同產(chǎn)地同一基原的車前草表現(xiàn)出良好的相似度，聚類分析可以將2 種基原區(qū)分開(kāi)。本文結(jié)果為車前草藥材的質(zhì)量控制和基原鑒別提供了可靠的分析方法與參考依據(jù)。

表8 25批車前草大車前苷、木犀草苷、車前草苷D與毛蕊花糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果Table 8 The determination results of Plantagoside,Cynaroside,Plantainoside D and Acteoside in 25 batches of samples w/%