一株用于菌糠發酵的木霉菌株的篩選及其培養工藝

鐘麗娟 趙新海

摘要：以污染香菇菌棒和黑木耳菌棒的木霉為來源，篩選到一株適用于菌糠發酵的木霉菌株X-05，對峙培養試驗結果表明，菌株X-05對番茄灰霉病病菌和黃瓜枯萎病病菌均具有較好的抑菌效果。以廢棄香菇菌糠、黑木耳菌糠作為培養基質，測定外源氮源、水分及pH值對木霉菌絲生長及產孢的影響，結果表明，香菇菌糠、黑木耳菌糠均適合木霉生長，在尿素添加量為3%、料液比為1 g ∶ 2.5 mL、初始pH值為4.5～5.0的條件下，于30 ℃培養7 d后香菇菌糠、黑木耳菌糠的產孢量可達3.67×109～7.00×109 CFU/g。

關鍵詞：香菇;黑木耳;菌糠;綠木霉;pH值

菌糠是指食用菌菌棒采收后廢棄的固體培養料，其成分主要為尚未被完全利用的纖維素、木質素、粗脂肪和食用菌菌絲體等。目前，食用菌產業已經成為我國第六大種植產業，產量已超過3 000萬t，同時產生了大量廢棄菌糠。近年來，研究人員針對菌糠的綜合利用開展了大量研究，主要集中在將其用作畜禽飼料、有機肥料、蔬菜基質、生物質顆粒、食用菌培養料等方面[1-3]，積極推動了食用菌產業鏈條的延長。此外，生物防治土傳病害的潛力和效果越來越得到重視，其中利用木霉菌防治作物各類病害的效果及其作用機制已有大量相關報道，美國、以色列、中國、印度、瑞典等多個國家已經實現木霉制劑的商品化應用[4-6]。但在實際生產中，生物防治常存在使用成本高、見效慢、產品貨架期短等問題，其中見效慢是由生物防治與化學防治的作用機制不同造成的，而使用成本高、產品貨架期短歸根結底其實是由生防菌劑生產成本高、菌株抗逆性和定植能力差等導致的[7-8]。開展利用廢棄菌糠培養木霉的研究，一方面可以解決木霉等生防菌定植難的問題，另一方面可有效資源化利用廢棄菌糠，對于推廣植物病害的生物防治和農業廢棄物的資源化循環利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

木霉菌株來源于喀左縣尤杖子鄉香菇種植基地的香菇染菌棒和喀左縣大營子鄉黑木耳種植基地的黑木耳染菌棒。

番茄灰霉病病菌（Botrytis cinerea）、黃瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporum）由沈陽農業大學植物保護學院吳元華教授饋贈。

1.2 培養基

綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基配方：200.0 g馬鈴薯（去皮），20.0 g葡萄糖，1.5 g MgSO4·7H2O，3.0 g KH2PO4，18.0 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水，pH值為6.0。菌糠培養基配方：取粉碎后過60目篩的香菇菌糠細粉100.0 g，加入1 000 mL蒸餾水煮沸15 min，再加入瓊脂20.0 g至完全溶化，定容至1 000 mL后，分裝到500 mL三角瓶中。馬丁氏培養基配方：5.0 g蛋白胨，10.0 g葡萄糖，1.0 g KH2PO4，0.5 g MgSO4·7H2O，20.0 g瓊脂，1 000 mL 蒸餾水，pH值自然。每1 000 mL培養基中加3.3 mL 1%孟加拉紅水溶液。臨用時在每 100 mL 培養基中加0.3 mL 1%鏈霉素溶液。上述培養基于121 ℃滅菌30 min，冷卻后備用。

1.3 原料來源

黑木耳菌糠取自遼寧省朝陽市喀左縣大營子鄉大營子村黑木耳種植基地，培養基配方如下：78%木屑、19%麩皮、1%石灰、1%石膏，出耳5潮后，自然風干、粉碎并混合均勻備用，經測定，pH值為569。香菇菌糠取自遼寧省朝陽市喀左縣尤杖子鄉后鋼溝村香菇種植基地，培養基配方如下：78%木屑、19%麩皮、1%石灰、1%石膏，出菇5潮后，自然風干、粉碎并混合均勻備用，經測定，pH值為4.83。

1.4 菌株分離

在無菌條件下用剪刀將染菌棒剪開，用接種針挑取木霉產孢濃密部位的培養料，接種至事先倒好的綜合PDA培養基上，每個樣品設5次重復。將接種后的培養皿于28 ℃培養，定期觀察菌落形態并進行鏡檢，挑取目的菌落邊緣的菌絲，接種至綜合PDA平皿中央進行純化，根據菌落來源進行編號，純化2～3次后，分別將菌種轉接至斜面綜合PDA培養基上，于28 ℃培養至斜面長滿菌絲后，于4 ℃冰箱保存。

1.5 菌株篩選

1.5.1 菌株的初篩 挑取冰箱中保藏的、大小約為0.5 cm×0.5 cm的各菌株組織塊，接種至綜合PDA平板培養基中央，于28 ℃恒溫培養48 h后，分別用6.0 mm打孔器打取菌落邊緣菌絲，將菌苔分別接種至事先倒好的含有菌糠培養基的平皿中央，于28 ℃恒溫培養，定期觀察菌落的生長情況。培養72 h后，用游標卡尺采用十字交叉法測定木霉菌落的直徑，挑選出3株在菌糠培養基上生長良好的木霉菌株并標記清楚，培養120 h后分別用20 mL無菌水洗滌平板上的木霉孢子，制成孢子懸浮液，適當稀釋后采用計數器計數法測定孢子數量[9]。

1.5.2 菌株復篩 分別將初篩得到的3株木霉、番茄灰霉病病菌和黃瓜枯萎病病菌接種至事先倒好的綜合PDA平皿中央，于28 ℃培養72 h（黃瓜枯萎病病菌需培養120 h）后，用6.0 mm打孔器沿菌落邊緣打取菌落，將木霉接種至綜合PDA平皿中央，番茄灰霉病病菌或黃瓜枯萎病病菌按等邊三角形接種3點，通過對峙培養進行抑菌效果的測定。待木霉菌絲與病原菌菌絲接觸后，用游標卡尺測定木霉和病原菌的菌落半徑。通過初篩、復篩，確定1株木霉作為菌糠發酵用木霉菌株。

1.6 菌株鑒定

將復篩獲得的木霉接種至綜合PDA培養基上，用于觀察菌落形態。另取平板，距離接種點約 2 cm，用滅菌鑷子各斜插入4片滅菌蓋玻片，用于觀察菌絲、孢子等顯微形態。將平板于28 ℃培養，定期觀察菌落生長情況，及時進行分生孢子梗、分生孢子及菌絲的顯微觀察。

真菌的形態學鑒定參照魏景超的《真菌鑒定手冊》[10]和Gams、Bissett的分類系統檢索表[11]。

1.7 菌株生物學特性測定方法

1.7.1 溫度試驗 設置15、20、25、30、35、40 ℃等6個溫度處理，培養基為綜合PDA。

1.7.2 pH值試驗 用1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH分別將綜合PDA培養基的pH值調至3、4、5、6、7、8，制成不同pH值的培養基。將4 ℃冰箱保藏的菌株轉接至綜合PDA平板上，培養48 h備用。用直徑為6 mm的打孔器將準備好的菌落平板制備成菌苔。將各培養基制備成平板并做好標記，用移植針將菌苔轉接至平板中央，在進行溫度試驗時，分別將各處理放入15、20、25、30、35、40 ℃培養箱中，在進行其他處理時，將平板置于30 ℃恒溫培養箱中進行倒置培養。定期觀察并使用游標卡尺測量，采用十字交叉法測定菌落的直徑。

1.8 菌株產孢培養工藝的研究

在菌株生物學特性研究的基礎上，以香菇菌糠、黑木耳菌糠為主要培養基質，以木霉分生孢子產生量作為檢測指標，測定外源氮、水分及pH值對木霉菌絲生長及產孢的影響。在試驗設計中結合生產的可操作性，作如下設計：（1）料水比試驗。A1處理添加100%香菇菌糠，料液比為1 g ∶ 1.5 mL;A2處理添加100%香菇菌糠，料液比為1 g ∶ 2 mL;A3處理添加100%香菇菌糠，料液比為1 g ∶ 2.5 mL;A4處理添加100%香菇菌糠，料液比為1 g ∶ 3.0 mL。（2）pH值試驗。B1處理添加100%香菇菌糠，用1 mol/L HCl調節pH值至4.0，料液比為1 g ∶ 2.5 mL;B2處理添加100%香菇菌糠，用1 mol/L HCl調節pH值至4.5，料液比為1 g ∶ 2.5 mL;B3處理添加100%香菇菌糠，用1 mol/L NaOH調節pH值至5.0，料液比為1 g ∶ 2.5 mL，B4處理添加100%香菇菌糠，用1 mol/L NaOH調節pH值至6.0，料液比為 1 g ∶ 2.5 mL。（3）氮源試驗。C1處理添加97%香菇菌糠、3%尿素，pH值自然;C2處理添加97%香菇菌糠、3%硫酸銨，pH值自然;C3處理添加97%香菇菌糠、3%磷酸銨，pH值自然。（4）黑木耳菌糠試驗。D1處理添加100%黑木耳菌糠，pH值自然;D2處理添加100%黑木耳菌糠，用1 mol/L HCl調節pH值至4.5;D3處理添加97%黑木耳菌糠、3%尿素，pH值自然。

將上述各處理三角瓶于30 ℃恒溫培養7 d，定期觀察菌絲生長及產孢情況，培養7 d時將物料取出，自然風干后備用。采用奧立龍STAR-A211測定各培養料初始pH值及風干樣品10倍液的pH值，并在馬丁氏培養基上采用稀釋涂平板法測定各樣品的分生孢子數，在進行樣品稀釋時，用滅菌擦鏡紙過濾孢子懸浮液以除去木霉菌菌絲。

2 結果與分析

2.1 菌株分離與篩選結果

木霉感染食用菌菌棒后期會產生大量綠色分生孢子，較容易鑒別，從12棒香菇染菌棒、5棒黑木耳染菌棒上共分離到19株木霉，以香菇菌糠作為唯一營養源，測定各菌株在含10%香菇菌糠平板上的生長速度。由表1可知，木霉菌菌株在香菇菌糠培養基上的生長速度存在差異，但均可良好生長;相比較而言，菌株X-05、X-08、M-03的生長速度較快。采用血球計數板鏡檢法對3株木霉的產孢能力進行初步測定，由表2可以看出，3株木霉均具有較強的產孢能力，28 ℃培養120 h時，產孢量可達109～1010CFU/皿。

由表3、圖1和圖2可以看出，3株木霉對供試2株病原菌均具有較好的重寄生作用， 接種 2 d 后木霉菌與病原菌菌絲接觸，隨后病原菌受木霉拮抗而停止生長，木霉繼續向病原菌菌落上生長、產孢，最后覆蓋整個菌落。通過比較可以看出，菌株X-05對供試2株病原菌的拮抗效果最好，與其對峙培養的病菌菌落直徑小，并且產孢略早。

2.2 菌株X-05的形態學鑒定結果

菌株X-05在綜合PDA平板上生長較快，在生長初期菌落為白色，培養72 h后開始變稀疏并產孢，后期因產生大量分生孢子而使菌落呈深綠色，產孢后常出現同心輪紋狀。菌落背面初期無色，后期略呈淺黃色。菌絲透明，直徑為1.8～3.2 μm，有隔，細胞壁光滑，分生孢子梗由菌絲直立生出，無色，分支多，對生或互生2～3級分支;分支與分生孢子梗間近似呈直角，末端為小梗，小梗呈瓶形，頂部縊縮，分生孢子無色，球形或橢圓形，大小為（2.2～2.9） μm×（2.4～3.5） μm，分生孢子常在孢子梗頂端聚集成團狀（圖3）。參照魏景超的《真菌鑒定手冊》和Gams、Bissett的分類系統檢索表，鑒定菌株X-05為綠木霉（Trichoderma viride Pers.ex Fr.）。

2.3 菌株的生物學特性研究

2.2.1 溫度對菌株X-05菌絲生長的影響 由表4可以看出，菌株X-05在15～40 ℃范圍內均可生長，溫度對其生長的影響顯著，最適生長溫度范圍為25～30 ℃;當溫度低于20 ℃時或高于35 ℃時，菌絲生長緩慢。

2.2.2 pH值對菌株X-05菌絲生長的影響 結合菌糠初始pH值及生產上的可操作性，測定pH值為3～8對菌株X-05菌絲生長的影響。由表5可以看出，菌株X-05菌絲在供試pH值條件下均生長良好，其中酸性環境更適于木霉菌菌絲的生長與產孢，最適pH值為4～5。

2.4 菌株X-05產孢培養工藝研究

以香菇菌糠、黑木耳菌糠作為培養基質，研究料液比、外加氮源及pH值對木霉菌絲生長及產孢的影響。由表6可以看出，當料液比為1 g ∶ 2.5 mL時，培養料含水量適宜，表層不易失水，三角瓶底部無積水，木霉菌絲生長旺盛，培養料的產孢量更大，原因可能是培養時間長時，料液比過低易導致表層失水干燥，而含水量過高易造成瓶底積水，出現染菌。外加氮源對木霉菌菌絲生長有促進作用，其中添加尿素、硫酸銨的效果明顯優于添加磷酸銨的效果。試驗結果表明，初始pH值對木霉菌菌絲生長及產孢具有明顯影響，當培養料的初始pH值為 4.0～5.0時，木霉菌菌絲生長更旺盛，產孢時間早，產孢量大。

3 結論與討論

木霉是食用菌生產中比較常見的雜菌，嚴重危害了食用菌生產。從另一個角度看，木霉是生物防治土傳病害的主力軍，特別是對于設施蔬菜生產而言，常年大量使用化肥農藥而導致的不良后果已經受到人們的關注，生物防治理念及其相關產品的推廣應用將成為熱點。在實際生產中，有機肥的銷售半徑受限，受經濟收益的限制，很多菌糠利用技術尚未得到有效應用，因此在菌糠利用時，應盡可能考慮就近消化利用。針對縣域種植業、養殖業和食用菌產業的特點，擬探索適合區域應用的菌糠利用模式，構建農業廢棄物循環經濟模式。喀左縣的食用菌產業以香菇和黑木耳為主，設施蔬菜生產以黃瓜、辣椒、茄子、番茄等為主。近年來，隨著種植年限的延長，土傳病害問題日益凸顯，本研究以喀左縣主栽食用菌香菇、黑木耳菌糠為基礎，篩選得到一株既可以在菌糠上良好產孢又兼具生防效果的木霉菌株。模擬培養試驗結果表明，菌糠粉碎后，在尿素添加量為3%、料液比為1 g ∶ 2.5 mL、初始pH值為4.5～5.0、30 ℃條件下培養7 d，產孢量可達3.67×109～7.00×109 CFU/g，符合農用微生物制劑菌數高于0.5億/g的產品要求，具有較好的應用前景。但應注意的是，香菇、黑木耳菌糠及木霉培養物的pH值均為酸性，直接施用于土壤存在使土壤酸化的風險，其使用方法及施用量還需要深入研究。

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