超聲波協同半仿生法提取黑木耳多糖工藝優化

郝慧敏，縱偉

（1.鶴壁職業技術學院，河南 鶴壁 458030；2.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002）

黑木耳（Auricularia auricular）又稱云耳、木菌，屬真菌門、擔子菌綱、木耳科、木耳屬，性平、味甘，是著名的藥食兩用真菌[1]，素有“菌中之冠”之稱。黑木耳多糖是黑木耳中含有的一種生物活性成分，研究表明其具有抑制腫瘤[2]、調節免疫力[3-4]、降血脂[5]、抗氧化[6]、調節血糖[7]、延緩衰老[8]、抗突變[9]、抗炎[10]、抗菌[11]等功效，在食品和保健醫藥領域應用廣泛。

目前，黑木耳多糖提取方法有熱水浸提法、稀堿浸提法、酶法、微波輔助法、超聲波輔助法和超微粉碎法等[12-17]，傳統的提取方法存在著提取率低、提取時間長、能耗大等缺點[18]。半仿生提取法（semi-bionic extraction，SBE）是一種新的提取技術，它是基于“灰思維”方式，模擬人體胃腸環境，在一定的酸、堿度溶液中依次連續提取，從生物藥劑學角度，以模擬給藥的方式建立的一種提取技術[19-22]。超聲波輔助提取是利用超聲的空化效應、熱效應和機械振動等作用，加速提取的進行[23]。目前超聲波協同半仿生法提取黑木耳多糖的研究還未見報道。因此，本文以黑木耳為主要原料，采用超聲波協同半仿生法提取黑木耳多糖，通過正交試驗對其工藝進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳：市售；葡萄糖、檸檬酸、鹽酸、無水乙醇、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、硫酸、苯酚（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

RE-2000B旋轉蒸發儀：濟南鑫貝西生物技術有限公司；BAS124S分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；TDL-50B臺式低速離心機：上海安亭科學儀器廠；UV-2450紫外-可見分光光度計：島津企業管理（中國）有限公司；HH-M4電熱恒溫水浴鍋：上海赫田科學儀器有限公司；PHS-3C酸度計：上海雷磁儀器廠；JY92-ⅡDN超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 超聲波協同半仿生法提取黑木耳多糖

根據半仿生法的原理，在模擬人體胃腸道環境的pH值分別為1.4、7.5和8.3的條件下，準確稱取經烘干、粉碎后的黑木耳粉樣品10 g，分別在上述pH值的溶液中，協同超聲波法（一定的料液比、超聲功率、超聲時間、超聲溫度）各提取1次，3次提取液合并后在5 000 r/min條件下離心10 min，然后將上清液減壓濃縮，濃縮液加3倍體積95%的乙醇后，在4℃冰箱中靜置24 h，然后在5 000 r/min條件下離心10 min，沉淀物經真空干燥得到黑木耳粗多糖。

1.3.2 黑木耳多糖的測定

采用苯酚-硫酸法[24]進行測定。

1.3.3 黑木耳多糖提取率的計算

黑木耳多糖提取率根據下列公式計算[25-26]。

式中：c為由標準曲線計算得到的多糖質量濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；N為稀釋倍數；m為黑木耳干粉質量，g。

1.3.4 單因素試驗設計

準確稱取10 g黑木耳粉5份，在模擬人體胃腸道環境的pH值分別為1.4、7.5、8.3的條件下，按1.3.1的方法進行超聲波協同半仿生法提取黑木耳多糖，考察不同因素對黑木耳多糖提取率的影響。在固定其中3個因素水平的條件下，對余下1個因素設計5個不同水平的試驗，固定條件為：料液比 1∶30（g/mL），超聲功率400 W，超聲溫度60℃，超聲時間50 min。分別選取料液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），超聲功率 100、200、300、400、500 W，超聲溫度30、40、50、60、70 ℃，超聲時間 30、40、50、60、70 min 進行單因素試驗。

1.3.5 正交試驗

在上述單因素試驗的基礎上，選取表1中所列的4個因素，采用L9（34）正交試驗對黑木耳多糖的提取工藝進行優化。試驗水平設計見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factor levels of orthogonal experimental design

1.4 數據處理

采用Office進行作圖，正交設計助手ⅡV3.1專業版進行正交試驗數據分析和方差分析。

(5)基準指代,此類指代與前4類是不同的,也是面向事件的指代與傳統指代的不同點,前4類中存在指代的兩個要素都是指向同一實體,而此類指代并非指向同一實體,而是以先行要素為基準,來確定照應要素的具體位置,例如“香溪洞景區”←“附近山體”.

2 結果與分析

2.1 單因素試驗研究

2.1.1 料液比對提取率的影響

料液比對多糖提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ration on the extraction rate

由圖1可知，黑木耳多糖提取率隨著溶劑量的增加逐漸升高，當料液比達到1∶30（g/mL），再繼續增大溶劑的量，多糖提取率變化趨緩。這可能是因為，增加溶劑的量，黑木耳細胞內外的濃度差增大，傳質速率就會加快，提取率升高；但當溶劑達到一定量時，溶質溶出基本完全，再繼續增加用量，提取率也不再明顯升高而是趨于穩定。故取料液比1∶30（g/mL）為佳。

2.1.2 超聲功率對多糖提取率的影響

超聲功率對多糖提取率的影響見圖2。

圖2 超聲功率對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction rate

由圖2可知，多糖提取率隨著超聲功率的增加呈現先升高后降低的趨勢，在超聲功率400 W時，多糖提取率達到最大，再繼續增加超聲功率，提取率反而降低。這可能是因為，增加超聲功率，促使超聲波的超聲和機械效應增強，超聲波對黑木耳細胞破壁程度增強，多糖溶出增多，提取率升高；當超聲功率大于400 W后，超聲波在其聲源附近，會產生大量的空化氣泡，形成空化屏蔽的環境，導致空化泡不能充分崩解，提取率降低。故取超聲功率400 W為佳。

超聲溫度對多糖提取率的影響見圖3。

圖3 超聲溫度對提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate

由圖3可知，多糖提取率隨著超聲溫度的升高呈現先升高再降低的趨勢，在超聲溫度為60℃時，多糖提取率達到最高，再繼續提高超聲溫度，提取率反而降低。這可能是因為，增加超聲溫度，溶劑擴散速度加快，多糖溶出增多，提取率升高，當溫度大于60℃后，再繼續升高溫度，多糖會發生降解，提取率降低。故取超聲溫度60℃為佳。

2.1.4 超聲時間對多糖提取率的影響

超聲時間對多糖提取率的影響見圖4。

圖4 超聲時間對提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction rate

由圖4可知，多糖提取率隨著超聲時間的延長而逐漸升高，當超聲時間達到40 min后，再繼續延長超聲時間，多糖提取率也不會明顯升高而是趨于穩定。這可能是因為，增加超聲時間，黑木耳細胞破碎程度和數量增加，多糖溶出增多，提取率升高，當超聲時間超過40 min后，多糖已溶出完全，不會再明顯變化。故取超聲時間40 min為佳。

2.2 超聲波協同半仿生法提取黑木耳多糖的工藝正交優化研究

正交試驗結果見表2。方差分析見表3。

表2 正交試驗結果Table 2 The result of orthogonal experimental design

表3 方差分析結果Table 3 The variance analysis results

由表2、表3的數據分析可知，4個因素的影響主次順序為：A＞C＞B＞D，得出最優組合為 A2B3C2D3。料液比和超聲溫度對黑木耳多糖提取率的影響達到了顯著水平，其它不顯著。通過R值分析，超聲波協同半仿生法提取黑木耳多糖的最佳工藝參數為：A2B3C2D3。該最優組合與正交試驗表2中的較優組合A2B2C3D1不一致，故需進行驗證試驗，重復試驗3次，取其平均值，其結果見表4。

表4 正交試驗驗證結果Table 4 The result of orthogonal experimental verifies

由表4可知，最終超聲波協同半仿生法提取黑木耳多糖的最佳工藝組合為：A2B3C2D3，即料液比 1∶30（g/mL），提取溫度60℃，超聲功率500 W，超聲時間60 min。在此最優組合條件下，得到黑木耳多糖提取率為22.52%（3次平均值）。

3 結論

本試驗采用超聲波協同半仿生法提取黑木耳多糖，經正交試驗優化，最佳工藝參數為：料液比1∶30（g/mL），提取溫度60℃，超聲功率500 W，超聲時間60 min，在此條件下，黑木耳多糖提取率為22.52%，本試驗為黑木耳多糖的提取提供一種新的方法。