牛磺酸對卵形鯧鲹腸道微生物及免疫功能的影響

馬啟偉 ，郭 梁, ，劉 波, ，劉寶鎖, ，朱克誠, ，郭華陽, ，張 楠, ，楊靜文, ，張殿昌,

（1. 上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306； 2. 中國水產科學研究院南海水產研究所/農業農村部南海漁業資源開發利用重點實驗室，廣東 廣州 510300； 3. 廣東省海洋生物種業工程技術研究中心，廣東 廣州 510300）

?；撬?(Taurine) 是一種β含硫氨基酸，化學名為2-氨基乙磺酸 (C2H7NO3S)，以游離或者小肽的形式存在于組織中；牛磺酸在魚體內具有多種生物學功能，在生長性能、神經調節、滲透調節、免疫應答、抗氧化狀態、抗應激能力、解毒作用、配子質量、消化酶活性和腸道微生物菌群結構中發揮著重要作用[1-2]。有研究表明，植物性蛋白對魚類的生長、免疫、腸道微生物菌群有顯著性影響，植物性蛋白替代魚粉不僅會導致魚類免疫能力下降，還會造成腸道微生物菌群的改變；引起金鯛(Sparus aurata)[3]、大西洋鮭 (Salmo salar)[4]、大菱鲆 (Scophthalmus maximus)[5]、絲尾鳠 (Hemibagrus wyckioides)[6]、條石鯛 (Oplegnathus fasciatus)[7]、虹鱒 (Oncorhychus mykiss)[8]、日本鰻鱺 (Anguill japonica)[9]腸道菌群改變、形態異常并引發炎癥反應。然而?；撬崮軌蛟黾又参镄缘鞍状骠~粉的使用量，緩解不良反應[10]；一些研究證實飼糧中添加牛磺酸對不同大小和種類的魚類腸道微生物菌群和腸道免疫產生有益影響；例如，飼糧中添加?；撬峥捎行Ь徑馍帻X鱸 (Dicentrarchus labrax)[11]豆粕替代魚粉產生的腸道異常并提高草魚 (Ctenopharyngodon idella)[12]的腸道免疫功能。

魚類腸道中的微生物菌群被稱為宿主的第二基因組，是腸道黏膜屏障的重要組成部分，與機體免疫系統密切相關，腸道菌群的穩定保證了腸道健康，如果腸道菌群紊亂則極易引起宿主腸道疾病[13]。?；撬岬亩喾N生理功能已使其成為研究熱點，然而，關于?；撬釋λ鷦游锬c道影響的資料有限，且多集中于消化酶代謝、腸道形態和屏障功能等方面，對腸道免疫的研究較少。Toll樣受體 (TLRs)/NF-κB信號通路在先天免疫中發揮重要作用，TLRs將病原相關分子刺激信號轉導入細胞內，導致NF-κB轉錄因子活化，能介導IL-1β以及TNF-α等炎癥介質發揮其促炎作用[14]。?；撬岷投喾N細胞因子之間存在潛在關系，牛磺酸能夠抑制TLRs/NF-κB信號通路、改善炎癥損傷，能夠調節免疫基因在魚腸道中表達[15]；另外，當機體處于炎癥時，?；撬岙a生的氯胺也具有抗炎和細胞保護作用[16]。

卵形鯧鲹 (Trachinotus ovatus) 為暖水性、中上層洄游魚類，由于其生長迅速、肉質鮮美，已成為南海沿海地區重要的養殖魚類[17]。研究表明以植物性蛋白替代魚粉時，會對卵形鯧鲹生長、抗氧化和免疫，以及腸道微生物菌群產生顯著性影響[18-20]。另外，本試驗前期研究發現?；撬崮軌蛱岣呗研析K鲹生長性能和抗氧化能力[21]；基于?；撬釋χ参镄缘鞍滋娲~粉產生的不利影響具有緩解作用，本試驗旨在探討?；撬釋β研析K鲹腸道微生物菌群和免疫方面的影響，為明確植物蛋白替代飼料中添加?；撬崾欠裼绊戶~體內腸道菌群多樣性及免疫功能提供有力證據，以期為卵形鯧鲹健康養殖提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料及飼養管理

試驗以魚粉、發酵豆粕和玉米蛋白粉作為蛋白源，魚油作為脂肪源，共配制了5種不同牛磺酸添加量的等氮等脂飼料，所有飼料原料粉碎后過40目篩網，加入魚油和水混勻，經過制粒機 (G-500，華南理工大學) 制成2.5 mm的沉性飼料顆粒，于4 ℃密封保存。基礎試驗日糧粗蛋白和粗脂肪質量分數分別為427和100 g·kg?1；灰分和水分質量分數分別為83和101 g·kg?1；各組?；撬豳|量分數分別為 1.3 g·kg?1(T0)、4.4 g·kg?1(T1)、7.4 g·kg?1(T2)、10.5 g·kg?1(T3)、12.7 g·kg?1(T4)[21]。

飼養試驗在海南省新村港進行，所有試驗用魚均采于中國水產科學研究院南海水產研究所，將750尾大小均一、體質健康的卵形鯧鲹 (81.0±0.5) g隨機分配到15個網箱 (1 m×1 m×1.5 m) 中，隨機分成5組 (每組150尾，分為3個平行)。試驗開始前使用T0組飼料喂養1周，使試驗魚適應人工飼料與飼養環境。試驗開始時試驗魚已饑餓24 h，然后每組魚用相對應的飼料每天飽食投喂2次 (8:00和16:00)，持續8周。試驗期間溫度28～32 ℃，pH 7.4～8.3，鹽度 34～36，溶解氧質量濃度＞6.0 mg·L?1。

1.2 樣品采集

喂養階段結束后，將魚饑餓24 h，從每個網箱中隨機取9尾，用丁香酚 (上海醫療器械股份有限公司) 麻醉，使用2.5 mL不含肝素的注射器從尾靜脈采血，離心后 (3 000×g, 4 ℃, 10 min) 取血清于?20 ℃保存；冰上解剖取其腸道，剔除腸道周邊脂肪，每一樣品單獨放于對應的2 mL凍存管中，液氮速凍，?80 ℃保存，用于腸道微生物分析(n=9) 和免疫基因的表達 (n=9)。

1.3 血清免疫指標測定

根據酶活試劑盒 (北京華英生物技術研究所)說明書，測定補體C3/C4和免疫球蛋白 (IgA、IgG、IgM) 的含量和溶菌酶 (LZM) 活性。

1.4 腸道微生物多樣性測定

1.4.1 DNA提取及PCR擴增 按照天根DNA試劑盒 [ 天根 (北京) 生化科技有限公司 ] 說明書提取卵形鯧鲹腸道細菌DNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，Nanodrop 2000檢測純度和濃度。無菌水稀釋DNA樣本至1 ng·μL?1，使用特異性引物對細菌16S rDNAV3–V4可變區進行PCR擴增，PCR 反應體系 (30 μL) 為 15 μL 的 Phusion Master Mix (新英格蘭生物實驗室)、3 μL的正反引物、10 μL (5～10 ng) 的模板 DNA、2 μL 的 ddH2O。PCR反應條件為98 ℃預變性1 min；98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環30次；72 ℃延伸5 min。PCR產物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；對目的條帶使用膠回收試劑盒(Qiagen，德國) 回收產物。引物序列見表1。

表1 細菌16S rDNA V3—V4可變區引物Table 1 Bacterial 16S rDNA V3–V4 corresponding primers

1.4.2 文庫構建和上機測序 使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，經過Qubit和Q-PCR定量保證文庫合格后，基于Ion S5 XL測序平臺，利用單端測序的方法，完成16S V3–V4區域測序。

1.4.3 測序數據處理 從下機數據中拆分出各樣本數據，截去Barcode和引物序列后，使用FLASH(V 1.2.7, http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/) 對每個樣本的reads進行拼接，得到的拼接序列為原始數據。對原始數據進行過濾去除干擾序列，得到有效的高質量數據。

利用Uparse軟件 (Uparse V7.0.1001, http://www.drive5.com/uparse/)對有效數據進行OTUs聚類和物種分類分析；依據其算法原則，篩選出OTUs的代表序列 (OTUs中出現頻數最高的序列)，用Mothur方法與SILVA132 (http://www.arbsilva.de/) 對每個OTU的代表序列做物種注釋，使用MUSCLE (V3.8.31, http://www.drive5.com/muscle/)軟件進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統發生關系。得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時對OTUs進行豐度、Alpha多樣性 (ACE指數、Chao1指數、香農-威納指數、辛普森指數) 計算、Beta多樣性 (主坐標分析和NMDS分析) 分析，以得到樣品內物種豐富度和均勻度信息。利用R軟件 (V 2.15.3) 繪制稀釋曲線。

1.5 腸道免疫基因表達分析

卵形鯧鲹腸道總RNA使用總RNA提取試劑盒 (廣州美基生物科技有限公司) 提取，NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA) 和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度和質量；使用PrimeScript? with gDNA Erase逆轉錄試劑盒逆轉錄得到cDNA，?20 ℃保存備用。

使用Primer Premier 5設計ToTLR1、ToTLR2、ToNF-kB P65、ToTNF-α、ToIL-1β和ToIL-10 的特異性引物，以卵形鯧鲹EF-1α作為內參[22]，引物序列見表2。使用Roche LightCycler 480 II進行基因表達測定，qPCR反應體系為12.5 μL，1 μL cDNA 模板 (60 ng·μL?1)，1 μL 正反引物，4.25 μL ddH2O和6.25 μL SYBR Pre-mix ExTaq；反應條件為95 ℃ 預變性30 s，95 ℃ 變性5 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環40次。每個樣品設3個重復，試驗數據使用2?△△CT進行計算[23]。

表2 卵形鯧鲹腸道免疫基因引物序列Table 2 Real-time quantitative PCR primers for immune related genes in T.ovatus

1.6 數據分析

以上數據采用SPSS 22.0 (IBM) 軟件進行處理和單因素方差 (One-way ANOVA) 分析，結果用“平均數±標準誤 (X±SE) ”表示，若差異達到顯著水平 (P＜0.05)，則采用Tukey's進行多重比較。

2 結果

2.1 腸道微生物分析

2.1.1 序列分析 通過對Reads拼接，平均每樣品測得87 707條tags，經過質控平均得到82 257條有效數據，以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，共得到5 382個OTUs。通過與數據庫Silva132比對，進行物種注釋，并對不同分類層級統計發現：能夠注釋到數據庫的OTUs數目為5 130 (95.32%)，門水平的比例為89.61%。試驗組的稀釋曲線和Rank Abundance曲線見圖1，各組稀釋曲線逐漸趨于平坦，說明測序數據量漸進合理，測序覆蓋范圍已基本達到樣品中所有的物種。

圖1 卵形鯧鲹腸道微生物稀釋曲線 (a) 和Rank abundance曲線 (b) (n=9)Figure 1 Rarefaction (a) and Rank abundance (b) curve of intestinal microbial diversity of T. ovatus

2.1.2 Alpha多樣性分析 卵形鯧鲹腸道微生物Alpha多樣性指數見圖2，Alpha多樣性可以反映樣本內的微生物群落的豐富度和多樣性變化，ACE指數和Chao1指數反映菌群豐富度，香農-威納指數 (Shannon) 和辛普森指數 (Simpson) 反映菌群多樣性，且兩者間呈現正相關，數值越大，表示菌群的豐富度和多樣性越高。Alpha多樣性結果顯示，隨?；撬岷康脑黾?，T1、T2和T3組的ACE指數和Chao1指數顯著低于T0組 (對照組，P＜0.05)；T2組的香農-威納指數和辛普森指數最低，香農-威納指數顯著低于T0和T4組，辛普森指數顯著低于T0、T3和T4組 (P＜0.05)。

圖2 牛磺酸對卵形鯧鲹腸道微生物Alpha多樣性分析 (n=9)*. 差異顯著 (P＜0.05)；**. 差異極顯著 (P＜0.01)Figure 2 Alpha diversity analysis of intestinal microbial diversity of T. ovatus*. Significant difference (P＜0.05); **. Very significant difference (P＜0.01)

2.1.3 Beta多樣性分析 Beta多樣性分析 (圖3)可以評估腸道中物種復雜性方面的差異程度，距離越接近的樣本，表示物種組成結構越相似，結構相似度高的樣本傾向于聚集在一起；主成分 (PCoA)和無度量多維標定法 (NMDS) 分析顯示，T1、T2和T3組傾向于聚集在一起，物種相似度較高；T1和T4組間樣品距離較遠，傾向于離散分布，物種組成結構相似度較低。

圖3 卵形鯧鲹腸道微生物Beta多樣性分析分析 (n=9)Figure 3 Beta diversity analysis of intestinal microbiota of T. ovatus

2.1.4 腸道菌群組成及其相對豐度分析 卵形鯧鲹在門水平腸道菌群組成及其相對豐度見圖4，所有試驗組腸道微生物菌群在門水平上主要注釋到10個門和其他的未知微生物群體，占據主導地位的主要包括變形菌門、軟壁菌門、螺旋體門。T0—T4組變形菌門相對豐度分別為19.6%、11.6%、10.8%、28.1%、41.1%。T0—T4組軟壁菌門相對豐度分別為45.1%、60.4%、56.9%、33.2%、37.0%；T0—T4組螺旋體門相對豐度分別為23.0%、6.4%、12.8%、23.8%、4.1%。T0—T4組擬桿菌門相對豐度分別為1.5%、12.4%、8.7%、5.1%、4.2%。腸道菌群組成及相對豐度分析顯示，隨飼料外源?；撬岷康脑黾樱囼灲M變形菌門、軟壁菌門、螺旋體門和擬桿菌門的相對豐度出現顯著性變化，TI和T2組變形菌門相對豐度較T0組分別減少了8.0%和8.8% (P＜0.05)；T1和T2組軟壁菌門相對豐度較T0組分別增加了15.3%和11.8% (P＜0.05)；T1、T2和T4組螺旋體門相對豐度較T0組分別減少了16.6%、10.2%和18.9% (P＜0.05)；T1和T2組擬桿菌門相對豐度較T0組分別增加了10.9%和7.2% (P＜0.05)。卵形鯧鲹在屬水平腸道菌群組成及其相對豐度見圖5，占據主導地位的主要包括支原體菌屬、短螺旋體屬和甲基桿菌屬。T3和T4組支原體菌屬相對豐度較T0組分別減少了17.4%和5.6% (P＜0.05)；T2和T3組短螺旋體屬相對豐度較對照組分別增加了13.7%和12.2% (P＜0.05)；T2、T3和T4組甲基桿菌屬相對豐度較T0組分別增加了3.3%、1.7%和1.4%。

圖4 基于門水平上的卵形鯧鲹腸道菌群物種相對豐度柱形圖 (n=9)Figure 4 Bacterial relative abundance in intestine of T. ovatus at phylum level

圖5 基于屬水平上的卵形鯧鲹腸道菌群物種相對豐度柱形圖 (n=9)Figure 5 Bacterial relative abundance in intestine ofT. ovatus at genus level

2.2 血清免疫指標

?；撬釋β研析K鲹血清免疫影響指標數據見表3。隨外源性?；撬岬臄z入，T2、T3和T4組的溶菌酶活性顯著提高 (P＜0.05)；T3組補體C4和免疫球蛋白 (A, G) 含量顯著高于T0組 (P＜0.05)；各組間的補體C3和免疫球蛋白M含量無顯著性差異 (P＞0.05)。

表3 牛磺酸對卵形鯧鲹血清免疫指標的影響Table 3 Effect of taurine on serum immune parameters of T. ovatus

2.3 腸道免疫基因表達

牛磺酸對卵形鯧鲹腸道免疫影響數據見圖6。結果顯示，牛磺酸對卵形鯧鲹腸道免疫基因的表達有顯著性影響；隨飼料?；撬岷康脑黾樱琓oTLR-1和ToTLR-2基因表達量呈現逐漸降低的趨勢，試驗組基因表達量顯著低于對照組 (T0,P＜0.05)；T1、T2和T4組的ToNFkB P65表達量顯著低于T0組 (P＜0.05)；T2、T3和 T4組的ToTNF-α和ToIL-1β的表達量顯著低于T0組 (P＜0.05)；T3和T4組ToIL-10的表達量顯著高于對照組 (P＜0.05)，T0、T1和T2組ToIL-10的表達量無顯著性差異(P＞0.05)。

圖6 免疫相關基因在卵形鯧鲹腸道中mRNA相對表達量Figure 6 Relative expression levels of immune-related genes in intestine of T. ovatus

3 討論

腸道微生物與宿主的健康息息相關，在營養物質轉化、吸收和免疫應答中起著重要作用；腸道微生物菌群提供了一個可操縱的腸道環境，為改善魚體健康，預防和治療疾病提供重要平臺。魚類腸道微生物菌群多樣性和結構特征會受到多種因素的影響，包括遺傳背景、棲息環境，飼料成分 (添加劑)、成長階段、藥物 (抗生素) 等[25]。?；撬崾鞘改c和結腸上皮細胞中最豐富的游離氨基酸，有著多種生物學功能，廣泛用于食品添加劑行業[26]。有研究顯示，牛磺酸能導致肉雞小腸長度、上皮細胞增殖和小腸結構相關的性能變化[27]；能夠調節大

鼠腸道微生態，抑制有害細菌的生長；能夠改變豬腸道黏膜的形態并促進腸黏膜損傷的修復[28]；在水生動物中，牛磺酸已經確定在多種魚類體內扮演重要角色，對腸道微生物及腸道免疫應答具有顯著性影響。本試驗中，腸道菌群Alpha多樣性和Beta多樣性分析結果顯示，飼料中?；撬岷磕軌蛘{節腸道微生物菌群的豐富度和多樣性，改變腸道菌群結構；在卵形鯧鲹腸道菌群組成中占據主導地位的主要包括變形菌門、軟壁菌門、螺旋體門，這與已有研究一致[29]。在不同種類生物中，腸道菌群組成和豐度往往存在很大差異，這與環境因子和飼養條件有很大關系，另外，正常與炎癥個體腸道菌群同樣存在顯著差異，在患有腸皺紋萎縮和固有層炎癥的大西洋鮭腸道中，乳球菌屬較正常個體顯著增加[30]。在門水平上，卵形鯧鲹變形菌門和軟壁菌門相對豐度隨?；撬岷匡@著變化，適當的?；撬崽砑幽芙档妥冃尉T和螺旋體門的相對豐度，提高軟壁菌門和擬桿菌門的相對豐度；Yu等[2]研究發現，?；撬崮芴岣叽笫髷M桿菌門和降低變形菌門豐度，這與本研究結果相似。?；撬嵩谌笪镔|代謝中起著重要作用，而擬桿菌門是多糖、膽固醇代謝和碳水化合物發酵的重要參與菌群[31]，改變擬桿菌門豐度有可能是牛磺酸調節三大營養物質代謝的另一原因；然而高濃度的牛磺酸含量會抑制其生長，原因可能是過量的?；撬釋е履c道處于高酸度環境，其不適于在這種酸性條件下生長[32]。在屬水平上，卵形鯧鲹支原體菌屬、短螺旋體屬和甲基桿菌屬隨牛磺酸含量發生顯著變化，支原體菌屬豐度顯著降低，短螺旋體屬豐度顯著增加，甲基桿菌屬也呈增加趨勢；優勢菌群往往會影響宿主自身微生物的組成和結構；腸道微生物結構的改變有可能會導致腸道疾病的產生，其在魚類腸道中發揮的作用還需進一步研究驗證。短鏈脂肪酸 (SCFAs) 具有多種生理學功能，能夠提供能量，促進鈉的吸收，改善腸道循環，抑制致病微生物的生長；研究表明?；撬崮軌蛱岣吣c道SCFAs含量，然而變形菌門中包含大多數的致病菌，?；撬嵊锌赡芡ㄟ^提高腸道SCFAs含量抑制致病微生物，降低致病菌豐度[2]。

?；撬崾敲庖叻磻挠行д{節劑，能夠通過調節淋巴細胞的增殖和抑制促炎介質的產生調節炎癥反應。溶菌酶是一種堿性蛋白質，具有溶菌、殺菌、抗病毒的作用，是評價魚類的非特異性防御能力的重要指標；血清補體系統是先天免疫的主要組成部分，補體C3和補體C4在補體的激活過程中發揮重要作用，能激活補體抵抗病原微生物侵入；免疫球蛋白是免疫活性分子中一種重要抗體，能特異性地結合抗原[33]。本試驗中卵形鯧鲹血清溶菌酶的活性顯著提高，補體C4和免疫球蛋白含量顯著增加，說明適量?；撬崮芴岣呗研析K鲹免疫能力。飼料中添加牛磺酸同樣能夠顯著增加黃鰭鯛(Acanthopagrus latus)[34]、黃顙魚 (Pelteobagrus fulvidraco)[35]、虹鱒[36]、草魚[12]的免疫能力。

動物腸道損傷導致腸道炎癥或先天免疫過程的發生，Toll樣受體 (TLRs) 是病毒、細菌、真菌的宿主傳感器，Toll樣受體 (TLRs)/NF-κB信號通路在多種脊椎動物先天免疫中發揮重要作用，注射了Poly (I∶C) 和LPS的點帶石斑魚 (Epinephelus coioides) 的TLR-1和TLR-2表達均顯著上調[37]。本試驗中飼料牛磺酸含量增加顯著下調腸免疫基因 ToTLR-1、ToTLR-2、ToNFκB P65、ToTNF-α 和ToIL-1β的表達；顯著上調腸免疫基因ToIL-10的表達。?；撬峋哂型ㄟ^抑制NF-κB的活化從而調節促炎性細胞因子在體內調節炎癥過程的能力，研究表明，?；撬峥梢哉{節感染鏈球菌炎癥反應期間TLRs/NF-κb信號通路，降低TLR-2和NF-κb P65的表達[15]。IL-1β和TNF-α的表達與TLRs有關，TLR可以激活MyD88依賴性途徑，通過NF-kB誘導IL-1β和TNF-α表達[38]。豆粕替代魚粉提高了鱸魚IL-1β和TNF-α的表達，而通過添加牛磺酸能夠顯著抑制兩促炎性因子表達，緩解了植物性蛋白引起的炎癥反應；?；撬崮軌蚪档痛笫笱錞NF-α活性和肉雞血漿TNF-α含量，這表明?；撬峥梢酝ㄟ^基因表達和酶活性兩個層次對炎性因子產生影響[11]。有研究發現，IL-10可以下調TNF-α表達，補充?；撬嵋部梢越档筒蒴~TNF-α基因的表達，這可能與IL-10有關[12]。IL-10是腸道中重要的抗炎細胞因子，IL-10上調有利于緩解由植物性蛋白替代引起的腸道炎癥，在本試驗中，有可能是?；撬嵋餓L-10基因表達的上調導致TNF-α表達受到抑制。內毒素是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分之一，與某些生物分子結合形成的化合物可引起毒性反應，有證據表明牛磺酸能夠減少炎癥細胞的浸潤和內毒素的含量，緩解小鼠炎癥引起的腸道黏膜損傷，這有可能是?；撬嵬ㄟ^抑制內毒素轉移來發揮作用；牛磺酸還能和多種物質結合形成在炎性反應中具有重要作用的牛磺酸代謝物 (TauCl等)，能夠抑制NF-κB的活化和NO、TNF-α、促炎白細胞介素等的生成，牛磺酸攝入有可能導致牛磺酸代謝物的增加，下調了促炎因子的表達[39]。

綜上所述，?；撬嵩诼研析K鲹腸道中發揮著重要的生理功能，對腸道菌群及免疫功能有著顯著的影響。?；撬崮芤鹉c道菌群相對豐度和結構的改變，導致優勢菌相對豐度的變化。牛磺酸能夠提高血清溶菌酶活性并增加免疫球蛋白數量，能夠調節腸道TLRs/NF-κB信號通路，下調促炎因子ToNFkB P65、ToTNF-α、ToIL-1β 和上調抗炎因子ToIL-10的表達，提高腸道免疫能力。