羧肽酶A4活化STAT3促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲*

禹卓玥，張蕙雯，楊婷，牛亞楠，孫立新，劉軍，遇瓏，冉宇靚，孫力超(國家癌癥中心，國家腫瘤臨床醫學研究中心，中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院分子腫瘤學國家重點實驗室，北京 100021)

肝細胞癌(HCC)屬于臨床上常見的惡性腫瘤。羧肽酶A4(carboxypeptidase A4,CPA4)屬于金屬蛋白酶家族，可在鋅離子的參與下切割肽或蛋白質的C端殘基[1]。CPA4基因位于染色體7q32區域，在細胞增殖和分化中具有潛在作用[2]。研究表明，CPA4的突變或印記異?？赡軙绊懬傲邢侔┑那忠u性[3]。據報道，CPA4在胰腺癌、胃癌、食管癌等多種腫瘤組織中呈異常高表達，且與腫瘤分期、轉移和預后不良有關[4]。然而，CPA4在肝癌中的功能及分子機制尚不清楚。本研究探討了CPA4在體外對2種肝癌細胞系的增殖、遷移、侵襲能力的影響，并初步研究其分子機制，旨在為尋找肝癌診斷和治療靶點提供依據。

1 材料與方法

1.1細胞系、試劑及儀器 肝癌細胞系MHCC97H、MHCC97L均由中國醫學科學院腫瘤研究所細胞生物學實驗室保存。DMEM F12培養基和胰蛋白酶(美國Hyclone公司)，胎牛血清(天津康源生物公司)，RIPA裂解液、脫脂奶粉、ECL發光液(北京普利萊公司)，兔抗CPA4多克隆抗體(美國Sigma公司)，兔抗GAPDH多克隆抗體(美國Bioworld公司)，兔抗STAT3單克隆抗體、兔抗p-STAT3(Tyr705)單克隆抗體和兔抗c-myc單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG二抗(美國Jackson公司)，CPA4過表達和干擾慢病毒載體(上海和元生物公司)，CCK8試劑(日本同仁化學研究所)，10 g/L的結晶紫溶液(北京索萊寶公司), 逆轉錄試劑盒(北京全式金公司)，SYBR Green Premix Ex Taq(上海翊圣生物公司)，qRT-PCR引物(北京擎科新業生物技術公司)，PVDF膜和Transwell小室(美國Millipore公司)，Matrigel基質膠(美國BD公司)，BCA蛋白質定量試劑盒、細胞培養箱(美國Thermo公司)，450型酶聯儀、電泳儀(美國Bio-Rad公司)，光學顯微鏡(日本Nikon公司)，超微量分光光度計(德國FoodALYT公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養及穩轉細胞系的構建 取凍存的肝癌細胞系MHCC97L和MHCC97H，復蘇后，重懸于含10%胎牛血清的DMEM F12培養基中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。

CPA4過表達載體和干擾載體的病毒包裝、滴度測定均由上海和元生物技術公司完成。shRNA的靶標序列：shCPA4：5′-GTATGACAACGGCATCAAA-3′。按慢病毒操作手冊進行感染，將對數生長期的肝癌MHCC97L和MHCC97H細胞分別以5×104個/孔的密度接種至24孔細胞培養板，保證第2天感染病毒時融合率達30%～40%。更換為950 μL新鮮培養基，分別用50 μL包裝過表達CPA4及其對照(vector組)的病毒感染肝癌MHCC97L細胞，另用50 μL包裝shCPA4及其對照(shNC組)的病毒感染肝癌MHCC97H細胞，4組細胞均加入5 μL聚凝胺(1 mg/mL)。病毒感染12 h后更換新鮮培養基，37 ℃、5%CO2條件下繼續培養，用于后續試驗。最終得到MHCC97L-vector、MHCC97L-CPA4、MHCC97H-shNC和MHCC97H-shCPA4共4組穩轉細胞系。

1.2.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 收集各組數量約為5×106個且處于對數生長期的MHCC97L和MHCC97H細胞，通過Trizol法提取總RNA，使用超微量分光光度計測定RNA的濃度和純度,選取濃度大于125 ng/μL，吸光度比值(A260/280 nm)為1.9～2.0的樣本用于后續實驗，置于-80 ℃保存。各組均取1 μg RNA用于后續實驗，使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，置于-20 ℃保存。引物序列參考文獻[4]，由北京擎科新業生物技術公司合成。GAPDH上游引物序列：5′-CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT-3′，下游引物序列：5′-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′；CPA4上游引物序列：5′-CCAGATGCCGAGGAAC-3′,下游引物序列：5′-TACGCCCAGTCGATGC-3′。以cDNA為模板進行qRT-PCR，反應體系為20 μL，包括10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，2×Power SYBR Green PCR Mastre Mix 10 μL，模板DNA 2 μL，無RNA酶水補足體積至20 μL。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。于60 ℃時用Step One Plus軟件采集熒光信號并進行熔解曲線分析，采用相對表達量2-ΔΔCt法計算。以GAPDH作為內參照，用CPA4與相應GAPDH的Ct差值表示樣品中目的基因的mRNA相對表達水平。

1.2.3總蛋白質提取及western blot 收集各組處于對數生長期的MHCC97L和MHCC97H細胞(約5×106個)，加入250 μL含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上靜置30 min，每隔10 min顛倒混勻1次，12 000 r/min離心15 min，小心吸取上清，采用BCA試劑盒進行定量。分別取35 μg總蛋白質樣品，進行含10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，積層膠采用90 V電壓，分離膠采用120 V電壓)，并轉移至PVDF膜上(80 V電壓2 h)。轉膜結束后，將膜置于50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h后，PVDF膜置于目的一抗中[稀釋比例分別為兔抗CPA4多克隆抗體1∶200；兔抗GAPDH多克隆抗體1∶5 000；兔抗STAT3單克隆抗體1∶1 000;兔抗p-STAT3(Tyr705)單克隆抗體1∶500；兔抗c-myc單克隆抗體 1∶1 000]，4 ℃溫育過夜。TBST洗滌4次，每次8 min，用HRP標記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)室溫溫育1 h，TBST洗滌4次，每次8 min，加入ECL發光液進行顯影。蛋白質條帶灰度值用ImageJ軟件測定，目的蛋白條帶相對灰度值=目的蛋白條帶的灰度值/內參蛋白條帶的灰度值。實驗重復3次并進行統計分析。

1.2.4CCK8試驗和克隆形成試驗 取各組呈對數生長期的肝癌MHCC97L和MHCC97H細胞制成單細胞懸液，以2 500個/孔的細胞密度接種于96孔細胞培養板中，每組設置5個復孔。37 ℃、5%CO2孵箱中分別于培養0、24、48、72和96 h時加入100 μL 10% CCK8試劑，溫育2 h后，使用酶聯儀測定450 nm波長處各孔的吸光度(A值)，取其均值，繪制生長曲線。

取各組呈對數生長期的肝癌MHCC97L和MHCC97H細胞制成單細胞懸液，計數，將細胞懸液稀釋為1×106/mL,10倍梯度稀釋至濃度為1×103/mL，每組分別接種500 μL于培養皿中，每組設3個復孔，輕輕轉動使細胞分散均勻。37 ℃、5%CO2條件下培養10～12 d，培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養。棄去上清液，PBS洗滌2次，無水乙醇固定30 min，棄去固定液，10 g/L結晶紫染液染色30 min，PBS洗滌2次，空氣干燥，拍照，肉眼直接計數克隆(大小約0.3～1.0 mm)。實驗重復3次。

1.2.5Transwell遷移試驗 將Transwell小室置于24孔細胞培養板中，用無血清培養基將細胞稀釋為2.5×105/mL濃度的懸液，取200 μL加入至小室的上室，下室加入650 μL 10%完全培養基，每組設置3個復孔。37 ℃、5%CO2條件下培養24 h，PBS洗滌2次，無水乙醇室溫固定30 min，PBS洗滌2次,用棉簽擦去上室細胞，10 g/L結晶紫染液染色30 min，PBS洗滌2次，晾干，切下小室并用中性樹脂封片。顯微鏡下觀察及拍照，隨機選取3個高倍鏡視野，計數穿膜細胞數。實驗重復3次。

1.2.6Transwell侵襲試驗 將Transwell小室置于24孔細胞培養板中，提前在每個小室中加入100 μL稀釋好的基質膠(基質膠∶雙無培養基=1∶9)，37 ℃、5%CO2條件下溫育1～2 h，棄去多余基質膠。用無血清培養基將細胞稀釋為2.5×105/mL濃度的懸液，取200 μL加入至小室的上室，下室加入650 μL 10%完全培養基，每組設置3個復孔。37 ℃、5%CO2條件下培養24 h，PBS洗滌2次，無水乙醇室溫固定30 min，PBS洗滌2次,用棉簽擦去上室細胞，10 g/L結晶紫染液染色30 min，PBS洗滌2次，晾干，切下小室并用中性樹脂封片。顯微鏡下觀察及拍照，隨機選取3個高倍鏡視野，計數穿膜細胞數。實驗重復3次。

2 結果

2.1western blot和qRT-PCR檢測CPA4mRNA及蛋白質在肝癌細胞系中的表達 western blot和qRT-PCR分析證實肝癌細胞系MHCC97H和MHCC97L均表達CPA4mRNA及蛋白質，且CPA4mRNA及蛋白質在MHCC97H細胞中的表達高于MHCC97L細胞。見圖1、表1。

圖1 western blot檢測CPA4蛋白在肝癌細胞系中的表達

表1 western blot和qRT-PCR檢測CPA4 mRNA及蛋白質在肝癌穩轉細胞系中的表達

2.2western blot和qRT-PCR檢測CPA4mRNA及蛋白質在肝癌穩轉細胞系中的表達 western blot和qRT-PCR檢測結果表明，CPA4mRNA及蛋白質在MHCC97L-CPA4組細胞的表達水平明顯高于MHCC97L-vector組，而在MHCC97H-shCPA4組細胞的表達水平明顯低于MHCC97H-shNC組。見圖2、表2。

圖2 western blot檢測CPA4蛋白在肝癌穩轉細胞系中的表達

表2 western blot和qRT-PCR檢測CPA4 mRNA及蛋白質在肝癌穩轉細胞系中的表達

2.3CCK8試驗和克隆形成試驗檢測肝癌細胞體外增殖能力 CCK8試驗結果顯示，在肝癌MHCC97L細胞中，與vector組相比，CPA4組細胞增殖能力顯著提高。見圖3A、表3。在MHCC97H細胞中，與shNC組相比，shCPA4組細胞增殖能力顯著降低。見圖3B、表3。克隆形成試驗結果顯示，在肝癌MHCC97L細胞中，vector組和CPA4組的克隆形成數分別為(183.3±34.74)個和(407.0±18.45)個，差異有統計學意義(t=5.686，P=0.005)。見圖3C。在肝癌MHCC97H細胞中，shNC組和shCPA4組的克隆形成數分別為(371.3±39.57)個和(137.7±30.28)個，差異亦有統計學意義(t=4.690，P=0.009)。見圖3D。

表3 CCK8試驗中不同時間點不同組別肝癌細胞的A值

注：A，CCK8試驗檢測過表達CPA4對肝癌細胞增殖的影響；B，CCK8試驗檢測敲減CPA4對肝癌細胞增殖的影響;C，克隆形成試驗檢測過表達CPA4對肝癌細胞增殖的影響；D，克隆形成試驗檢測敲減CPA4對肝癌細胞增殖的影響;*，P<0.01。

2.4Transwell試驗檢測肝癌細胞的體外遷移能力 結果顯示，在肝癌MHCC97L細胞中，vector組和CPA4組的遷移細胞數分別為(23.00±2.34)個和(123.50±2.18)個，差異有統計學意義(t=11.81，P<0.000 1)。見圖4A。在肝癌MHCC97H細胞中，shNC組和shCPA4的遷移細胞數分別為(135.30±6.42)個和(30.00±4.39)個，差異亦有統計學意義(t=13.52，P<0.000 1)。見圖4B。

注：A，Transwell試驗檢測過表達CPA4對細胞遷移能力的影響；B，Transwell試驗檢測敲減CPA4對細胞遷移能力的影響。

2.5Transwell試驗檢測肝癌細胞的體外侵襲能力 結果顯示，在肝癌MHCC97L細胞中，vector組和CPA4組的侵襲細胞數分別為(26.75±2.39)個和(112.30±9.43)個, 差異有統計學意義(t=8.782，P=0.000 1)。見圖5A。在肝癌MHCC97H細胞中，shNC組和shCPA4組的侵襲細胞數分別為(184.00±4.22)個和(32.57±2.49)個，差異亦有統計學意義(t=30.83，P<0.000 1)。見圖5B。

注：A,Transwell試驗檢測過表達CPA4對細胞侵襲能力的影響;B,Transwell試驗檢測敲減CPA4對細胞侵襲能力的影響。

2.6western blot檢測肝癌細胞中STAT3通路相關蛋白的表達 結果顯示，在肝癌MHCC97L細胞中，與vector組比較，CPA4組的STAT3總蛋白的表達水平差異無統計學意義，而p-STAT3和c-myc蛋白表達水平顯著升高；在肝癌MHCC97H細胞中，與shNC組比較，shCPA4組的STAT3總蛋白的表達水平差異無統計學意義，而p-STAT3和c-myc蛋白的表達水平顯著降低。見圖6、表4。

圖6 western blot檢測CPA4基因對肝癌細胞中STAT3通路相關蛋白質表達的影響

表4 western blot檢測CPA4基因對肝癌細胞中STAT3通路相關蛋白質表達水平的影響

3 討論

CPA4是羧肽酶A/B亞家族的成員，最早在由丁酸鈉誘導前列腺癌細胞分化過程上調的mRNA中被篩選鑒定出[5]。在本研究中，通過慢病毒載體感染分別建立CPA4過表達和敲減肝癌細胞系，CCK8試驗和克隆形成試驗結果顯示，過表達CPA4可以顯著促進肝癌細胞的增殖，而敲減CPA4后則顯著抑制肝癌細胞的增殖，與Pan等[6]在結直腸癌研究中以及Fu等[7]在非小細胞肺癌研究中的結果具有一致性，提示CPA4可能具有作為抑制腫瘤生長的治療靶點的潛力。同時，本研究通過Transwell試驗證實CPA4過表達后可以顯著促進肝癌細胞的遷移、侵襲，而敲減CPA4則能顯著抑制肝癌細胞遷移、侵襲。表明CPA4可能促進肝癌細胞的轉移。CPA4通過激活PI3K-AKT-mTOR通路促進上皮間質轉化(EMT)，促使胰腺癌細胞的增殖和遷移、侵襲[8]；CPA4還能通過激活STAT3和Erk，促進結腸癌細胞的增殖和遷移、侵襲[6]；同時，血清中CPA4含量可以預示臨床結腸癌患者的肝轉移[9]，提示CPA4具有作為肝癌生物標志物的潛力。

目前，尚未明確CPA4發揮其促進腫瘤細胞增殖、轉移的具體機制。作為一種可溶性外泌蛋白酶，CPA4在細胞外環境發揮重要作用，其神經肽底物已經被證實與細胞增殖和分化的調節相關[1]，而CPA4使得這些肽失活，可能會刺激腫瘤細胞的增殖或增強腫瘤的細胞移動性，這為CPA4與某些癌癥的侵襲性之間的聯系研究提供了實驗依據。一些新的研究報道為CPA4的分子機制研究提供了多項新的線索；如Shao等[8]報道在胰腺癌中CPA4通過激活PI3K-AKT-mTOR通路發揮重要作用；Pan等[6]發現在結腸癌中CPA4的功能與STAT3和Erk的激活相關。

STAT3是信號轉導及轉錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription,STATs)家族的成員，是該家族中與促進腫瘤生長和免疫抑制最密切相關的成員，通常在腫瘤浸潤性免疫細胞中過度激活[10]。STAT3的過度激活在多種致癌過程中具有重要作用，包括調節細胞周期、防止細胞凋亡、誘導生存因子和建立不受控制的生長[11]。本研究結果顯示，過表達CPA4使肝癌細胞中磷酸化STAT3和c-myc的表達水平升高；而敲減CPA4使肝癌細胞中磷酸化STAT3和c-myc的表達水平也降低。研究表明，STAT3蛋白的持續激活能夠提高c-myc、周期蛋白D1的表達而促進肝癌細胞的增殖、惡化；同時，STAT3的活化可以上調基質金屬蛋白酶(MMP)的表達，促進肝癌細胞的侵襲、轉移[12]。因此，本研究認為CPA4可能是通過激活STAT3信號通路促進細胞的增殖、遷移和侵襲，從而在肝癌生長、轉移中發揮重要作用。然而，本實驗僅檢測了STAT3信號通路的改變，而PI3K-AKT-mTOR通路和Erk通路對于CPA4功能的影響尚未進行研究，CPA4的下游直接相互作用靶點也尚未確定，還需要進一步深入的研究來闡明其在腫瘤發生、發展過程中的分子機制，以確認CPA4和STAT3作為肝癌治療和診斷靶點的潛能。