circRNA在胃癌中的研究進展*

李鑠，王茂葉，臧雪燕，蔣鵬程，許文榮，張徐(.江蘇大學醫學院&江蘇省檢驗醫學重點實驗室，江蘇鎮江03；.江蘇大學消化病研究所, 江蘇鎮江00)

胃癌是我國常見的消化系統惡性腫瘤之一[1]。盡管近年來胃癌的發病率有下降趨勢，但早期胃癌缺乏特異性臨床表現，許多患者確診時已處于進展期，喪失了手術機會。內鏡結合增強CT是目前診斷早期胃癌的金標準，但此法為有創操作，不易作為診斷和監測腫瘤進展的長期方法。血清學檢測癌胚抗原CEA、糖類抗原CA-199等指標對早期胃癌的敏感性和特異性不高。因此，尋找新的診斷標志物和治療策略尤為重要。

circRNA是一類新型的非編碼RNA，于20世紀70年代科學家研究植物病毒時被發現。既往研究人員認為circRNA是前體mRNA加工過程中的副產物或者錯誤剪接的結果，不具有生物學意義，未引起足夠重視。隨著高通量RNA測序(RNA-seq)技術和生物信息學的發展，circRNA現已被證實廣泛存在于各種生命體內，具有細胞信號傳導、蛋白質翻譯等重要的生物學功能，其異常表達影響著肺癌、肝癌及胃癌等多種腫瘤的發生、發展[2]。諸多研究[3-5]也已證實，circRNA可通過結合蛋白和作為miRNA的海綿吸附分子參與胃癌的發病過程，具有成為胃癌診斷、預后監測生物學標志物的潛能。本文分別從circRNA的結構功能、檢測方法及其與胃癌的相關研究進展作一綜述，以期對胃癌的診斷、療效分析等提供參考。

1 circRNA

1.1circRNA的結構與生物學功能 circRNA是一種單鏈共價閉合環狀的RNA。相比線性RNA，因其具有抵抗核酸外切酶的水解作用，故而穩定性更高。根據基因編碼環化方式，circRNA可分為外顯子circRNA(exonic circRNA，ecircRNA)、內含子circRNA(intronic circRNA，ciRNA)、外顯子-內含子circRNA(exon-intron circular RNA，EIciRNA)以及基因間circRNA(intragenic circular，icircRNA)4大類[6]。circRNA具有許多潛在生物學功能，例如，(1)作為miRNA的海綿吸附分子：circRNA能起到競爭內源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)的功能，通過競爭具有結合位點的miRNA，阻滯miRNA對其靶基因的抑制作用，進而調控相關mRNA表達[7]。(2)結合相關蛋白質：在細胞核中某些circRNA能夠與蛋白質結合，充當蛋白質的“分子誘餌”，影響下游靶基因表達[8]。(3)調節基因轉錄：ciRNA和EIciRNA可以通過與U1核內小核糖核蛋白(small nuclear ribo-nucleoproteins,snRNP)以及位于其親本基因啟動子上的RNA聚合酶Ⅱ(RNA-polⅡ)相互作用促進其親本基因轉錄表達[9]。(4)翻譯蛋白質：有學者在肝炎病毒中發現circRNA可直接翻譯蛋白質[10]。2017年,Legnini等[11]發現，circ-ZNF609在內部核糖體進入位點序列(internal ribosome entry site,IRES)驅動下翻譯小鼠成肌細胞中的蛋白質；Pamudurti等[12]發現,circMbl3可以翻譯果蠅中的蛋白質。以上研究證實了circRNA新的功能，為今后circRNA的研究提供了新的方向。

1.2circRNA檢測技術 隨著對circRNA醫學研究價值認識的深入，尋求快速、敏感、高效檢測circRNA的方法愈發重要。目前常用檢測circRNA的方法包括：(1)基因芯片技術(gene chip)：應用相對成熟的檢測技術，通過將已知序列的分子探針固定在基片上，與標記的樣本進行雜交，通過檢測樣本雜交信號的強弱及分布情況以確定RNA序列，其具有高通量、特異性高的特點，但相對“封閉”，只能檢測已知的序列，無法檢測未知的circRNA，使用成本較高。(2)逆轉錄-聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測技術：逆轉錄獲得cDNA，通過實時檢測擴增產物的數量，最終達到間接定量檢測circRNA的目的，該法廣泛應用于基因芯片結果的驗證以及circRNA在組織中表達水平的測定。但circRNA在體液中的含量極低，RT-PCR的敏感性無法滿足circRNA的基因檢測要求，此外，分析circRNA結果使用的2-△△Ct法需要人體內源性穩定表達的內參進行矯正，而目前缺乏相應的體液內參指標，限制了circRNA作為非侵入性診斷工具的應用。

鑒于上述檢測方法的局限，有學者在其原理基礎上進行改良，設計出針對外周體液中circRNA具有高敏感性的檢測方法。微滴式數字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是近年來對微量核酸表達進行快速、準確定量檢測的技術[13]。通過將含有circRNA目的基因的樣本進行微滴化預處理，使其形成納米直徑大小油包水的微滴，使單個微滴獨立進行PCR反應，通過微滴檢測器捕捉單個微滴的熒光信號，高于閾值的熒光信號判斷為陽性信號，否則判為陰性信號。按照泊松分布原理，通過計算得出原始樣本中circRNA濃度。ddPCR可準確得出目標核苷酸的濃度，適合對血清等體液中circRNA檢測，目前主要應用于病毒和核酸類腫瘤標志物的檢測。

為進一步提高檢測的敏感性，研究人員基于不同原理設計出新的檢測技術。例如，雙鏈特異性核酸酶(duplex-specific nuclease，DSN)是一種從勘察加蟹的肝臟胰腺中分離提取的核酸酶，其能夠對雙鏈DNA和DNA-RNA雜交體中DNA鏈進行專一裂解，但對RNA和單鏈DNA幾乎沒有作用。Jiao等[14]利用DSN酶的這種特性實現對circRNA的快速精準檢測。DSN酶介導的核酸酶誘導擴增反應是基于核酸酶水解作用形成的信號擴增技術，該方法直接在溶液中將DSN酶與circRNA混合進行快速檢測，實驗設計簡單，敏感性高，不需要PCR擴增過程，相較PCR減少假陽性結果。具體機制見圖1。

圖1 DSN酶介導的核酸酶誘導擴增反應對circRNA的檢測機制

滾環擴增(rolling circle amplification，RCA)技術由于其較高的擴增效率及相對簡單的反應條件，受到眾多研究者的關注，近年來廣泛用于生命領域的檢測。RCA反應體系中剪切酶在固定溫度下保持活性，使得反應可在恒溫條件完成，與PCR相比無需熱循環過程進行擴增，可減少反應裝置體積及成本。2019年，Liu等[15]在RCA反應原理基礎上設計出逆轉錄-滾環擴增(reverse transcription-rolling circle amplification，RT-RCA)技術。其首先在反應體系中加入脫氧核糖核酸(dNTPs)、剪切酶、環狀引物，讓環狀引物與circRNA結合，在ProtoScript Ⅱ逆轉錄酶作用下，以環狀引物為模板催化dNTPs形成反復銜接的環形核酸單鏈。而線性RNA無法產生足夠的重復序列，因此，可將circRNA與線性RNA進行鑒別，與傳統方法相比，其具有操作簡化、費用較低、敏感性高的特點。具體機制見圖2。

圖2 RT-RCA對circRNA的檢測機制

目前對于circRNA的功能研究還在不斷深入，創新的檢測方法對于促進circRNA的研究具有重要的作用。circRNA由于其豐度低、特異性不高，在高效檢測方面仍面臨許多困難。目前對于circRNA檢測的研究主要聚焦于如何提高檢測敏感性，降低檢測成本以及簡化操作等方面，未來便攜、靈敏、經濟、高通量、具有足夠特異性的檢測技術是最終發展的趨勢。表1將常見circRNA的檢測技術進行對比，根據檢驗目的并結合相關檢測技術特點，選擇經濟合理的檢測方法。

表1 circRNA的檢測技術

2 circRNA與胃癌

2.1circRNA在胃癌中發生、發展的作用

2.1.1具有致癌作用的circRNA RNA測序分析表明，circRNA在胃癌組織中高度特異性表達，其表達水平與胃癌的惡性生物學行為有密切關系[16]。Zhang等[17]采用qRT-PCR證實circNRIP1在胃癌細胞中相對正常胃黏膜上皮細胞呈過量表達(P<0.001)，circNRIP1可通過結合miR-149-5p激活AKT1/mTOR信號通路，提示其與胃癌的增殖、侵襲和遷移相關。另一項研究發現[18]，circPDSS1通過負調控miR-186-5p在體內外促進腫瘤細胞的增殖及侵襲，該負調控導致有絲分裂相關激酶2(never in mitosis gene A-related expressed kinase2，NEK2)的表達水平升高，影響DNA損傷和衰老調控機制。Zhu等[19]研究發現，circNHSL1與結合波形蛋白(vimentin，VIM)在胃癌組織中均呈高表達。大量研究證實，VIM與多種腫瘤的發展密切相關，通過進一步研究發現,circNHSL1與VIM之間存在靶向關系，circNHSL1結合miR-1306-3p使得同源異型盒基因(sine oculis homeobox homolog1，Six1)表達增強，產物Six1轉錄因子通過結合VIM啟動子區域，增強VIM表達，促進胃癌細胞的增殖。

2.1.2具有抑癌作用的circRNA Liu等[20]發現，相較癌旁組織，circ0002320在胃癌組織中呈低表達(P<0.001)，其進一步采用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)檢測結果顯示，circ-0002320和miR-367-5p共同在細胞質中定位，circ-0002320過表達上調細胞周期蛋白激酶抑制因子(p27 Kip1)在胃癌細胞中的表達，并抑制胃癌生長和侵襲。Zhang等[21]通過RNA數據庫進行生物信息學預測，circRNA表達譜數據分析以及RNA免疫沉淀技術驗證，推導出源自LARP4基因位點的circLARP4海綿吸附miR-424，其高表達抑制胃癌細胞增殖、侵襲。目前仍有大量的circRNA尚未發現，其影響胃癌生物學行為的具體機制仍需探索。涉及與胃癌調控相關circRNA見表2。

表2 調控胃癌相關的circRNA

2.2circRNA作為早期胃癌潛在診斷標志物 circRNA的特殊結構使其能在外周體液及組織中穩定存在，方便取樣檢測；此外circRNA在正常組織及腫瘤組織中的表達存在顯著差異，具有較高的特異性及敏感性，與腫瘤的發生、發展有較高的關聯性，這些特點使其具備作為非侵入性診斷標志物的條件。研究表明，circRNA具有臨床疾病早期診斷的潛在價值[23]。Wei等[24]研究發現，hsa_circRNA_102958在30例健康人對照者組織中的表達水平顯著低于胃癌患者，其作為診斷標志物的ROC曲線下面積(area under curve，AUCROC)為0.74，敏感性及特異性分別為0.61和0.86，表明hsa_circRNA_102958具有一定診斷價值。Zhao等[25]通過qRT-PCR檢測發現，hsa_circ_0000181在胃癌患者組織和血清中相對健康人呈低表達，且組織樣本的特異性為0.852，明顯高于血清樣本的0.206，而胃癌患者血清標本的敏感性為0.990，顯著高于組織標本的0.539，表明血清中的circRNA相較于組織作為早期胃癌潛在診斷標志物具有一定的優勢。

為進一步提高circRNA診斷早期胃癌的敏感性及特異性，有學者將幾種具有診斷價值的circRNA進行組合分析。例如，Li等[26]研究發現，hsa_circ_0061276和hsa_circ_0001017在胃癌患者血漿和組織中均呈低表達，其AUCROC分別為0.851和0.849，但將這2種標志物聯合分析，其AUCROC提高至0.912。表明與胃癌相關circRNA進行組合分析，其診斷精確度較單項結果更高。與胃癌診斷相關的circRNA見表3。

表3 與胃癌診斷和預后相關circRNA

2.3circRNA作為胃癌預后輔助標志物 胃癌具有易轉移、易復發、預后差的特點，尋找相關準確判斷胃癌患者預后的生物學指標，對于胃癌患者的臨床精準化治療具有重要意義。circRNA通過多種調控信號通路影響胃癌的發生、發展，調節胃癌細胞的遷移、侵襲、增殖和凋亡能力，目前已發現多種circRNA與胃癌的預后相關。Rong等[27]研究發現，circPSMC3在胃癌組織中下調，其進一步分析106例胃癌患者circPSMC3的表達水平并結合臨床病理資料，結果發現circPSMC3表達降低患者存在TNM分期升高、總生存期(overall survival，OS)縮短等現象，其鑒別診斷胃癌的AUCROC為0.93(95%CI：0.886～0.979，P<0.001)，當cut-off值為9.965時，其敏感性及特異性分別為0.85、0.95，表明circPSMC3可作為獨立預測患者預后的指標。Pan等[28]通過對108例胃癌患者臨床病理資料分析發現，circUBA1在胃癌組織中顯著高表達，其高表達與腫瘤體積、TNM分期相關；進一步進行多元生存分析發現，高表達circUBA1患者的生存預后明顯較差(16.7% vs 45.6%,P<0.001)。Wei等[29]研究表明，circHIPK3在胃癌細胞系及組織中表達顯著上調，通過circHIPK3/miR-107/BDNF通路調控胃癌進展，circHIPK3表達升高與胃癌患者預后不良顯著相關，有望成為胃癌預后判斷的良好檢測指標。

3 外泌體來源的circRNA與胃癌

外泌體是具有雙膜結構的微小囊泡，可由體內多種細胞(包括腫瘤細胞)分泌釋放，通過在細胞間傳遞生物活性分子進行生物信息交換并使受體細胞重新編程，源自腫瘤細胞的外泌體攜帶(包括circRNA等)囊泡內的生物分子釋放給其他受體細胞，促進腫瘤的發生和轉移[30]。研究發現，胃癌細胞以外泌體形式將cikS-133遞送至前脂肪細胞，通過激活結構域蛋白16(PR domain-containing 16, PRDM16)和抑制miR-133,以促進前脂肪細胞向棕色樣細胞的分化，在胃癌相關惡病質中發揮關鍵作用[31]。Xie等[32]研究發現，高表達外泌體circSHKBP1與胃癌患者預后不良相關，而手術治療后的胃癌患者體內外泌體circSHKBP1水平普遍下降，其進一步研究顯示，其通過抑制miR-582-3p使RNA結合蛋白(HUR)和血管內皮生長因子(VEGF)呈高表達，從而促進血管生成和誘導腫瘤發展。此外，外泌體circSHKBP1與輔助伴侶蛋白STUB1競爭性地與熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)結合，防止HSP90泛素化，共同促進胃癌細胞增殖。外泌體的脂質雙分子層囊泡能夠保護內容物不受核酸酶等微環境因素影響，有利于其在外周體液中循環流動，參與腫瘤的發生、發展，其作為circRNA的“天然運輸工具”為早期胃癌的診治提供一種新的思路。

4 小結及展望

circRNA作為miRNA海綿，抑制其功能，可影響下游多種信號通路調控相關癌基因的表達，促進胃癌的發生、發展。circRNA的特殊結構使其具備易獲取、敏感性高、特異性強、不易降解的特點，相較傳統檢測物更具優勢，更加符合作為胃癌早期診斷、預后評估生物學標志物的標準。但目前有關circRNA僅限于理論研究，缺乏進一步的臨床應用。究其原因主要包括：(1)已知的circRNA大部分在多種腫瘤中均有表達，缺乏在特定腫瘤中特異性表達而在其他腫瘤中正常表達的circRNA，無法做到精準檢測的要求；(2)分析檢測circRNA技術雖有發展，但仍無法滿足大規模檢測要求，限制了其在臨床中的應用；(3)缺乏大規模、系統規范獨立個體樣本的驗證，缺少高質量的臨床數據應用支持。

目前關于circRNA的研究還處于初級階段，存在大量circRNA的功能尚不可知以及在腫瘤中具體作用機制仍不清楚等問題，但circRNA自身初步展現的生物學特性使其在未來腫瘤領域具有巨大的研究價值。此外，仍需要加強circRNA的基礎研究成果向臨床應用方面的轉化，以期盡早實現對腫瘤的精準化診治。