腎透明細胞癌患者血清細胞外囊泡中miR-99b-3p水平檢測的臨床價值*

田亞萍，張明威，葛京平，張春妮，汪俊軍，王成(1.常州市第一人民醫院檢驗科，江蘇常州 213003；2.中國人民解放軍東部戰區總醫院 a.檢驗科，b.泌尿外科，南京 210002)

腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是腎臟常見的惡性腫瘤，且易對放、化療耐受，目前手術切除仍是首要治療方案。ccRCC尚缺乏有效的血清學標志物，病理活檢是ccRCC診斷的“金標準”，但因具有創傷性使其臨床應用受限[1]。目前已證實幾種血清蛋白質具有一定的診斷ccRCC或提示復發的價值，但其臨床應用價值尚不明確[2]。細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是細胞主動分泌的30～150 nm的囊泡，可攜帶miRNAs等生物活性分子在細胞組織間傳遞交流。因EVs miRNAs的釋放是一個主動過程，其作為腫瘤分子生物學標志物更具特異性[3]。miR-99b-3p在多種不同類型腫瘤中表達異常，而與其源于同一前體miRNA的miR-99b-5p，在ccRCC患者組織中呈低表達，且與酪氨酸激酶抑制劑治療的腫瘤進展有關[4]，提示miR-99b-3p亦可能與ccRCC密切相關。本研究擬通過檢測miR-99b-3p在ccRCC患者和健康人對照血清EVs中的表達水平，評估其作為輔助診斷ccRCC的潛在臨床價值。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2016年12月至2018年10月于東部戰區總醫院泌尿外科初診且確診為腎臟疾病患者的血清樣本100例。排除標準：(1)ccRCC伴有乙肝、結核、急性炎癥、腎腫瘤未確診或其他器官腫瘤；(2)接受過干預治療的ccRCC、ccRCC復發或最后被確診為非腎臟惡性腫瘤，如腎囊腫、腎良性腫瘤；(3)腎臟其他惡性腫瘤，如多房囊性腎細胞癌、嫌色腎細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、Xp11.2易位/轉錄因子E3(translocation facor E3，TFE3)基因融合相關性腎細胞癌。參照WHO腫瘤分型標準對所有患者手術切除樣本進行病理學確診，最終共有65例ccRCC患者樣本納入分析，且在入院之前均未進行任何治療，其中男37例，女28例，年齡(57.31±1.33)歲。按照Furhman分級標準[5]對腫瘤進行分級，其中Ⅰ級(高分化)5例、Ⅱ級(高分化)47例、Ⅲ級(中分化)10例、Ⅳ級(低分化)3例。75名健康人對照為同期在本院體檢中心就診的體檢者，男43例，女32例，年齡(56.54±1.55)歲，兩組間性別(χ2=0.002，P>0.05)、年齡(t=0.380，P>0.05)差異均無統計學意義。本研究經東部戰區總醫院醫學倫理委員會批準(No.2017NZGKJ-068)，納入對象均知情同意。

1.2主要試劑與儀器 分析純級別無水乙醇、異丙醇、氯仿(上海化學試劑公司)，ExoQuick-exosome試劑盒(美國CA公司)，AMV逆轉錄酶、rTaq酶、buffer、dNTP及MgCl2等均購自日本TaKaRa公司，除RNA酶水(美國Sigma-Aldrich公司)，Trizol試劑(美國Life Technologies公司)，miR-99b-3p及內參miR-16所用逆轉錄引物、TaqMan探針、7300型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，Tissuelyser-48全自動樣品自動研磨儀(上海凈信科技公司)，SAS67120型超純水機(美國Millipore公司)，5418型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.3標本前期處理與保存 抽取健康人對照體檢時和ccRCC患者治療前的空腹靜脈血3.5 mL于含分離膠的生化管中。1 500×g離心5 min后取血清，4 ℃、12 000×g離心5 min，進一步去除殘留血細胞和細胞碎片，將收集上清置于-80 ℃保存。

1.4血清EVs的提取 按照ExoQuick試劑盒操作說明書提取100 μL血清中EVs，并將其重懸于25 μL除RNA酶水中。

1.5EVs RNA提取 用Trizol試劑從EVs重懸液中提取RNA[6]，所得總RNA溶解于20 μL除RNA酶水后，置于-80 ℃保存待用。

1.6qRT-PCR檢測EVs miR-99b-3p水平 用基于TaqMan探針技術的qRT-PCR檢測EVs miR-99b-3p。首先將RNA逆轉錄為cDNA，逆轉錄反應體系：3.5 μL DEPC ddH2O、2 μL 5×buffer、1 μL反向引物、0.5 μL AMV酶、2 μL RNA和1 μL 10 mmol/L dNTPs，共10 μL，反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存，將所得cDNA樣本置于-20 ℃保存。qRT-PCR反應體系共20 μL，包括： 14.77 μL ddH2O、2 μL 10×PCR緩沖液、1.2 μL 25 mmol/L MgCl2、0.4 μL 10 mmol/L dNTP、0.3 μL rTaq酶、0.33 μL TaqMan探針和miRNA上、下游引物、1 μL cDNA。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。另外，以無RNA模板的ddH2O為陰性對照，每份樣本均進行3個復孔檢測。采用內參基因miR-16對結果進行校正以及計算EVs miR-99b-3p的表達水平；應用2-△Ct法[7]計算EVs miR-99b-3p相對于內參miR-16的表達水平，公式：△Ct=CtmiR-99b-3p-CtmiR-16。

2 結果

2.1ccRCC患者EVs miR-99b-3p水平變化 miR-16在ccRCC患者和健康人對照血清EVs中的表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。進一步利用miR-16對miR-99b-3p的水平進行校正和計算。qRT-PCR檢測結果顯示，ccRCC患者血清EVs miR-99b-3p水平[19.770(4.724，22.910)]顯著高于健康人對照組[5.830(2.046，7.862)]，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2ccRCC早期患者EVs miR-99b-3p變化水平 Ⅰ/Ⅱ級ccRCC(早期)患者的EVs miR-99b-3p水平[16.960(4.429，20.960)]和Ⅲ/Ⅳ級ccRCC患者(晚期)的EVs miR-99b-3p水平[27.490(5.248，37.060)]均顯著高于體檢健康者(P均<0.01)；但早期與晚期ccRCC患者EVs miR-99b-3p水平間的差異則無統計學意義(P>0.05)。

2.3ROC曲線評估EVs miR-99b-3p水平篩查ccRCC的效能 將ccRCC患者和健康人對照分別設為疾病組和對照組，繪制ROC曲線。根據Youden指數最大原則，確定cut-off值，并計算其RCC曲線下面積(AUCROC)、敏感性、特異性，評估EVs miR-99b-3p對于ccRCC的篩查價值，結果顯示，當取cut-off值6.483時，其篩查ccRCC患者與健康人對照的AUCROC為0.757(95%CI：0.674～0.840)；篩查早期ccRCC患者與健康人對照的AUCROC為0.754(95%CI：0.663～0.846)，篩查ccRCC及早期ccRCC的敏感性均為69.2%，特異性均為77.3%，但早、晚期ccRCC患者EVs miR-99b-3p水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：A，EVs miR-99b-3p對ccRCC篩查價值；B，EVs miR-99b-3p對早期ccRCC篩查價值。

2.4EVs miR-99b-3p水平與ccRCC的風險評估分析 在單因素Logistic回歸分析中，將ccRCC狀態作為因變量，EVs miR-99b-3p為自變量，結果顯示EVs miR-99b-3p與ccRCC密切相關(OR=7.677，95%CI：3.610～16.328，P<0.01)；校正性別、年齡、飲酒史及吸煙史等因素后，多因素Logistic回歸分析結果顯示，EVs miR-99b-3p仍是ccRCC患者潛在的獨立危險因素(OR=7.745，95%CI：3.596～16.682，P<0.01)。

2.5EVs miR-99b-3p水平與ccRCC患者臨床病理參數的相關分析 Pearson相關分析結果顯示，EVs miR-99b-3p與ccRCC患者的臨床分級、腫瘤大小、有無遠處轉移均無明確相關性(r值分別為0.018、-0.152、0.020，P均>0.05)。

3 討論

EVs miRNA與ccRCC的關系已有相關報道。ccRCC患者尿液EVs中的miR-126-3p、miR-449a以及miR-34b-5p可作為ccRCC潛在的非侵入性診斷性尿液生物標志物[8]。Dias等[9]分析來自32例ccRCC原位癌患者手術前后及37例伴隨轉移的ccRCC患者血漿EVs miRNA圖譜，結果發現，與術前相比，術后EVs hsa-miR-25-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-200c-3p和hsa-miR-301a-3p的水平降低，而hsa-miR-1293水平升高；與原位癌患者相比，已發生轉移患者的hsa-miR-301a-3p水平升高，而hsa-miR-1293水平降低，提示hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-1293可作為轉移性ccRCC的腫瘤標志物。

本研究通過qRT-PCR檢測miR-99b-3p在ccRCC患者血清EVs中的表達水平，發現相比于健康人對照，ccRCC患者血清EVs miR-99b-3p顯著升高。ROC曲線分析提示，血清EVs miR-99b-3p對ccRCC的診斷有潛在應用價值，但對早期患者尚不具備更好的診斷效率。同時Logistics回歸結果顯示，miR-99b-3p是ccRCC的獨立危險因子。然而，本研究尚存在一些不足：(1)樣本量不夠充足，已有數據無法證實EVs miR-99b-3p與ccRCC的臨床分期、腫瘤大小、是否發生轉移相關；(2)EVs miR-99b-3p的具體來源、去向及分子調控機制并不清楚，對其調控的靶基因以及生物學功能還需進一步研究；(3)患者隨訪時間較短，無法評估EVs miR-99b-3p對ccRCC預后價值；(4)ccRCC組織中miR-99b-3p的表達水平如何，是否與EVs表達一致尚不清楚。后期我們將擴大樣本量并加強隨訪以及增加組織樣本進一步探討。

miR-99b在多種不同類型腫瘤中發揮不同作用，如miR-99b通過抑制κB-Ras2和mTOR基因的表達，促進腫瘤相關巨噬細胞的吞噬作用和抗原呈遞能力，但具體調控機制尚不明確[10]；Li等[11]發現，miR-99b可抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，抑制人宮頸癌細胞的侵襲和轉移，并證實其以與mRNA 3′-UTR結合方式下調mTOR的表達。另外，Yao等[12]通過體外細胞實驗證實miR-99b-3p通過直接靶向原鈣黏蛋白19，促進肝癌細胞轉移和增殖，其調控機制也是在轉錄后水平與原鈣黏蛋白19 mRNA結合，且高表達的miR-99b-3p與肝癌患者的惡性臨床病理特征和較差的預后密切相關。由于miR-99b-3p和miR-99b-5p由同一前體經核酸內切酶處理而來，據此猜測miR-99b-3p亦可能與ccRCC的進展密切相關。本研究結果表明，miR-99b-3p在ccRCC患者血清中EVs表達水平升高，且對ccRCC具有潛在的診斷價值，但對其潛在的靶基因、其對靶基因的調控是經典的轉錄后水平或通過其他方式進行調控，以及如何影響ccRCC的生物學行為仍需進一步研究。