在微球透鏡輔助下的成像研究

張劍邊填軒李輝張炆濤李萌萱

(山東建筑大學 理學院，山東 濟南250101)

0 引言

光學顯微鏡是由不同焦距的透鏡組合而成的一種光學系統，豐富了人們對于微觀世界的認識，在生產、生活、科研和醫療等領域應用非常廣泛。 分辨率和放大率是衡量顯微鏡性能的重要參數，主要取決于透鏡的焦距。 光學顯微鏡的極限放大率為1 600 倍，在使用油浸介質的情況下達到2 000 倍，極限分辨率則可達200 nm[1]。 由于高質量的光學顯微鏡的價格昂貴，因此利用低倍顯微鏡實現高分辨率和超分辨可以大大降低使用成本。

CHEN 等[2]提出了納米光子噴流的概念，用時域有限差分法計算了當平面光束經過介電圓柱時的衍射圖像，圓柱的另一側陰影區域出現了束腰小于波長的光斑，強度為入射光強的150 倍，傳播大約兩個波長的距離時光斑沒有明顯的衍射，當電介質圓柱折射率變小時，光斑從圓柱內逐漸移動到圓柱表面外側。 納米光子噴流已應用于光學超顯微[3-4]、微粒操控[5-6]、輔助共聚焦顯微[7]，還可以實現增強拉曼散射和增強熒光顯微[8]。 科研人員通過改變環境介質折射率[9]和介觀尺寸電介質材料的結構降低納米光子噴流的半峰寬，增加發射長度和改變光束扭曲程度。 已經證明的結構有串聯微結構[10]、透明介質微球埋入透明介質立方體結構[11]、蜘蛛絲形成的紡錘結構[12]、雙層透明介質微圓柱[13]、雙透明介質微半圓柱[14]等，此外雙納米光子噴流也已得到證明[15]。

在光學超顯微領域，主要討論了尺寸＜50 μm的透明介質微球放在樣品表面提高顯微鏡分辨率的作用，微球到樣品的距離和在樣品上的位置都很難控制。 研究人員認為納米光子噴流越長，改變微球到樣品的距離時，能夠得到清晰放大圖像的位置就越多[16]。 文章研究了尺寸＞200 μm 透明介質微球，其相當于短焦距的透鏡，使用光學平移臺和細金屬絲可以方便地改變其位置且操作方便。 應用幾何光學可以計算出焦點的位置，通過改變透明介質微球焦點和樣品之間的距離，既可以成實像也可以成虛像，還可以調整放大率。 透明介質微球體積小，幾十克的微球其數量可達到幾千或者幾萬，單個介質微球的成本非常低，因此應用介質微球輔助低倍顯微鏡可提高分辨率和放大率，減少昂貴的高分辨顯微鏡的使用，大大降低了實驗成本。

1 理論分析

波動光學和幾何光學都可以用來計算透明介質微球的納米光子噴流位置。 當球的尺寸與波長相當時可用波動光學，而當微球的尺寸遠大于波長時則可用幾何光學。 一般認為尺寸＞50 μm 的微球的焦點位置的計算可以采用幾何光學。 在傍軸光線條件下，透明介質微球可以看作是厚透鏡，應用兩次球面物象折射公式，可以計算出焦點位置。 透明介質微球焦點計算原理如圖1 所示。P為物點，P′、P″分別為經過第一、第二個球面成像的像點。n1和n2分別為透明介質微球左、右兩邊的介質折射率，n為介質球的折射率，O和O′分別為左、右球面的中心，S、S″分別為經過第一、二個球面成像的物距和像距，S′和S′ -2r為第一、二個球面成像的像距和物距，r為球面半徑。

根據球面物像折射公式[1]，透明微球的成像規律由式(1)和(2)表示為

當平行光入射時，S ＝∞，因此像距由式(3)～(5)表示為式中f ′為焦點到O′的距離。

當n1＝n2時，f ′由式(6)表示為

當n1＝n2＝1 時，焦點到球心的距離由式(7)表示為

焦點到微球球面距離與微球半徑比值隨折射率的變化曲線如圖2 所示。 焦點到球面的距離隨著折射率的升高而減小，焦點光斑的半角寬度增加，從而顯微數值孔徑增加，這是透明介質微球能夠提高分辨率的原因之一。 當折射率為2 時，焦點落在透明介質微球表面；當折射率＞2 時，焦點進入透明介質微球內部。

圖2 焦點到微球球面距離與微球半徑比值隨折射率的變化曲線圖

透明介質微球的放大率由物距和焦點的位置決定。 成虛像時，放大率由式(8)表示為

式中m為放大率；u為物距。n增加時，f減小，物距不變時，放大率減小；n不變時，物距增加，放大率增加。

成實像時，放大率由式(9)表示為

2 實驗設備與材料

采用低倍光學顯微鏡，其目鏡為10 倍，而物鏡分別為4、10、40 倍，光源采用商用發光二極管(Light Emitting Diode，LED)白光光源。 用膠水將透明介質微球固定在細銅絲的一端，另一端固定于螺旋測微器，調整螺旋測微器可以改變透明介質微球到樣品的距離，距離的精度為10 μm。 用螺旋測微器測量蓋玻片的厚度為170 μm。 樣品有植物根尖永久裝片、洋蔥細胞永久裝片和臨時裝片。 實驗采用硅膠、玻璃和鈦酸鋇等3 種材料的透明介質微球，折射率分別為1.46、1.50 和1.90。 二氧化硅微球的直徑為600～1 000 μm、玻璃微球的直徑為1 000 μm、鈦酸鋇微球的直徑約為200 μm。 透明介質微球成像分為:(1)S＜f，成放大的虛像；(2)f＜S＜2f，成放大的實像；(3) 玻璃微球和硅膠微球對比；(4) 透明介質微球焦點直徑的測量；(5)光學超分辨。透明介質微球顯微原理如圖3 所示。

圖3 透明介質微球顯微原理圖

3 實驗結果分析

3.1 微球輔助成放大虛像

采用自制洋蔥表皮細胞裝片作為顯微樣品，樣品放置在蓋玻片上。 顯微圖像如圖4 所示，in為歸一化圖像強度，圖像顯示采用log-log 方式，圖像矩陣均為150 pixel×150 pixel。 10×4 倍(目鏡放大倍數×物鏡放大倍數)時樣品顯微原圖如圖4(a)所示，細胞壁和細胞核都清晰可見。 顯微鏡10×4 倍下加入透明硅膠微球，并且微球與樣品接觸，因此物距為球的半徑，顯微圖像如圖4(b)所示，由于S＜f，因此成放大的虛像。 圖4(c)為顯微鏡10×4 倍下加入透明硅膠微球的顯微圖像，調整螺旋測微器增加透明硅膠微球和樣品間的距離，使虛像放大倍率最高，加入透明硅膠微球后分辨率和放大率明顯提高。圖4(b)和(c)中的虛線正方形表示細胞相同的位置，虛線正方形邊長的像素數分別為12、60 個，說明放大率提高到原來的5 倍。 圖4(d)為10×40 倍顯微原圖，根據細胞壁厚度可以判斷圖4(c)和(d)的放大率相當，所以圖4(c)的放大率約為400 倍，是沒有透明硅膠微球顯微原圖放大率的10 倍。 4 張圖的圖像強度最大值分別為5.5、4.8、4.2 和90，說明透明硅膠微球對光線有衰減作用。 微球和樣品距離增加時圖像強度也減小，這是由于光通量降低了，400 倍顯微原圖中物鏡距離樣品最近，通光量也就最大。

圖4 洋蔥細胞裝片的顯微圖像(虛像)

3.2 微球輔助成放大實像

3.2.1 微球輔助放大實像的放大率

采用的透明硅膠微球直徑為860 μm，由式(8)得其焦距f為682 μm，樣品采用根尖細胞永久裝片。 調整增加透明硅膠微球和樣品距離，為了保證距離的準確，在樣品和透明介質微球中間放入3 片蓋玻片，永久裝片上封裝樣品還有一片蓋玻片，其厚度為170 μm，所以物距(樣品到微球中心距離)為1 110 μm(4 個蓋玻片厚度加微球半徑)。 在1 倍焦距(682 μm)和2 倍焦距(1 364 μm)之間，成放大的實像。 根尖細胞永久裝片顯微鏡原圖如圖5 所示，其中10×10 倍顯微鏡原圖如圖5(a)所示，放入透明硅膠微球的顯微圖如圖5(b)所示。 在兩圖中根尖細胞相同的位置做線掃描，像素個數分別為17、47，圖像放大了2.8 倍。

圖5 根尖細胞永久裝片顯微圖像

3.2.2 微球輔助放大實像的分辨率

采用透明硅膠微球的直徑為630 μm，由式(8)得其焦距f為500 μm，樣品為洋蔥細胞永久裝片。在透明介質微球和樣品之間放入3 個蓋玻片，加上樣品自帶的蓋玻片，物距為995 μm。 在1 倍焦距(500 μm)和2 倍焦距(1 000 μm)之間，成放大的實像。 圖6(a)為10×10 倍的洋蔥細胞顯微原圖，圖6(c)為放入透明硅膠微球后的顯微圖像，在細胞核的對應位置做線掃描(圖中虛線所示)，線掃描的圖像強度分別如圖6(b)和(d)所示，分別有5 和6 個峰值。 圖6(d)提供了更多的信息，圖6(b)中第5個峰值的半峰寬為15 個像素，圖6(d)中第5 和6個峰值的半峰寬為5 個像素，因此有硅膠透明介質微球時，圖像分辨率提高了3 倍。 但是有透明硅膠微球時圖像強度有所降低，這使得圖像的襯度降低，并且由于透明硅膠微球的聚焦作用，圖像強度成高斯分布，在圖像中形成了明顯的亮斑，也降低了圖像襯度。

圖6 洋蔥細胞永久裝片顯微圖像和對應位置圖像強度

3.3 玻璃微球和硅膠微球對比

玻璃和硅膠的折射率分別為1.50、1.46。 根據折射率的大小，玻璃微球的分辨率應該大于硅膠微球的分辨率。 玻璃微球和硅膠微球的顯微圖像如圖7 所示。 可以看出，圖7(b)顯示了更多的信息，箭頭所示位置的顆粒更加清晰，而圖7(a)圖像模糊。這說明微球的質量，像平整程度、內部缺陷等因素也會影響圖像的質量。

3.4 焦點直徑測量結果

幾何光學認為光的波長為零，在均勻介質中沿著直線傳播，當光線經過兩種介質的分界面時會發生折射和反射，并改變其偏振面。 由于忽略了衍射效應，所以平行光經過透明介質微球全部匯聚在一點上。 因此，利用幾何光學方法計算焦點的位置，只能給出焦點到球面的距離，而無法給出焦點光斑的尺寸。 焦點光斑直徑決定了透明介質微球成像的分辨率。 進一步用實驗測量焦點光斑尺寸測量[17-18]，顯微鏡的像素分辨率與焦點光斑直徑的像素數相乘就得到焦點光斑的大小。

測量透明介質微球焦點直徑的光路如圖8 所示。 30 mW 的532 nm 綠色激光首先通過中性衰減片，光強衰減，避免顯微鏡互補金屬氧化物半導體(Complementary Metal Oxide Semiconductor，CMOS)相機飽和，然后光束經過直角反光鏡射向透明介質微球，透明介質微球放在蓋玻片上，近似認為蓋玻片對激光束波前沒有影響，衍射光束進入光學顯微鏡，顯微鏡放大率為10×4 倍，CMOS 相機記錄衍射光束。

上下移動顯微鏡物鏡，進行連續拍攝，得到一組衍射光場的二維圖像，用差值法組合成衍射光場的三維圖像。 (1) 粗調顯微鏡物鏡，找到透明介質微球的焦點；(2) 反復細調，中心光斑最小的一張顯示焦點光斑的大小。

圖7 根尖細胞顯微圖像

圖8 測量透明介質微球焦點直徑光路圖

為了標定聚焦條件下CMOS 相機單個像素的分辨率，先測量銅絲的直徑。 金屬絲的硬度較大，在螺旋測微器夾持下不易發生形變，不影響測量的準確性，而透明介質微球在螺旋測微器夾持下變形嚴重，無法用來標定顯微鏡。 在銅絲的10 個不同位置用螺旋測微器測量其直徑，聚焦條件拍攝銅絲的顯微圖像，利用MATLAB 軟件對銅絲顯微圖像進行顯示，如圖9 所示。 10 個位置測量的銅絲直徑和像素數結果見表1，其平均直徑為0.156 mm，銅絲長度平均像素個數為111.5 個，兩者相除得到CMOS 相機每個像素的分辨率為1.4 μm。

測量4 個透明介質微球的焦點直徑，如圖10 所示。其中，圖10(a)硅膠介質微球1的直徑大于圖10(b)硅膠微球2 的直徑。

4 個透明介質微球的焦點直徑見表2。 對于透明硅膠球1 和2，球的直徑減小，焦點的直徑也減小；透明玻璃微球焦點最大，并且出現多個強度和大小接近的光斑，散焦嚴重，這是圖7(a)比(b)模糊的原因。 透明鈦酸鋇微球焦點直徑最小，并且聚焦效果良好。 4 個球中鈦酸鋇微球的分辨率最高。

圖9 銅絲40 倍顯微圖像

表1 銅絲的直徑和像素數表

圖10 透明介質微球衍射圖

表2 透明介質微球焦點直徑表

3.5 鈦酸鋇微球輔助超分辨

樣品為孔間距為125 nm 的雙通多孔氧化鋁(Anodic Aluminum Oxide，AAO)模板，電鏡照片如圖11(a)所示，虛線位置可以認為是AAO 模板的一個單元，由7 個直徑為125 nm 的微孔組成。 顯微鏡放大率為10×4，采用直徑為200 μm 的鈦酸鋇微球[19]。 將雙通AAO 模板放在載玻片上，用光學平移臺調整透明鈦酸鋇微球到AAO 模板的距離，使其與AAO 模板接觸。 在雙通AAO 模板與透明鈦酸鋇微球之間加入異丙醇，得到圖11(a)中虛線位置的顯微圖像如圖11(b)所示，分辨率達到了125 nm，小于光學顯微鏡的極限分辨率200 nm。

圖11 雙通AAO 模板電鏡圖和超分辨圖像

4 結論

通過理論計算和實驗結果分析，主要得到以下結論:

(1) 透明介質微球能夠提高顯微鏡的放大率和分辨率，放大率由焦點和樣品位置決定，分辨率由焦點光斑的位置和直徑決定，而兩者都和微球的大小和折射率有關；透明硅膠微球的顯微圖像的放大率可以是顯微原圖的10 倍。

(2) 約200 μm 的鈦酸鋇微球可以實現125 nm的超分辨，因為其直徑較大，比幾十μm 的透明介質微球操作方便，可以用來組成低價的超分辨系統；單個透明介質微球的成本較低，可以用來提高顯微鏡的放大率和分辨率，降低實驗室成本。