一種基于ATP熒光反應的潔凈度檢測系統的開發與驗證

柳江山 陶文靖 曲連海

摘 要：本文旨在建立一種基于ATP熒光反應的潔凈度檢測系統，并對該系統的主要性能指標進行驗證，包括線性、重復性、檢出限及衰減率等，并對檢測結果進行分析。結果顯示，本拭子對ATP標準溶液的檢出限為1.77×10-15mol/L，線性良好;對菌液的檢出結果為：大腸埃希氏菌檢出限2000CFU、金黃色葡萄球菌檢出限800CFU、酵母菌檢出限10CFU，均線性良好。該系統重復性良好，在高濃度ATP下，相對標準偏差（RSD）為8%;在低濃度ATP下，相對標準偏差為13%，均小于15%;在6min內，熒光衰減率無明顯變化。故得出結論，本拭子的靈敏度、線性、重復性和衰減率指標均較好。

關鍵詞：三磷酸腺苷? ATP熒光? 潔凈度? 驗證

隨著目前國內對于食品安全的重視程度越來越高，食品微生物檢測技術也在不斷革新。傳統的食品微生物檢測方法一般為平板計數法，但該方法步驟繁瑣，包括培養基制備、滅菌、樣品均質與稀釋、制備平板、恒溫培養等多項操作，耗時至少2天，費時費力，已無法滿足食品企業對于生產環境監測和質量控制的需求。此時，ATP熒光技術作為一種新的檢測技術提供了新的設計思路——通過對細胞中的ATP進行檢測，能夠在短時間內估算被測物體上殘留的微生物大致數量，從而實現對食品企業生產環境的快速檢測，且能快速報告結果，在大大縮短檢測時間的同時節省了人力與物力。

ATP又稱腺嘌呤核苷三磷酸（簡稱“三磷酸腺苷”），是一種不穩定的高能化合物，由1分子腺嘌呤、1分子核糖和3分子磷酸基團組成。ATP是生物體內最直接的能量來源，其在細胞中能通過與ADP的相互轉化實現貯能和放能，從而保證細胞各項生命活動的能量供應。ATP生物發光法是產生于20世紀70年代中期的一種ATP檢測方法，其檢測原理為在有氧條件下，熒光素酶催化熒光素和ATP之間發生氧化反應生成氧化熒光素并發出熒光。因此，熒光強度與ATP含量呈正比，即待測樣品中微生物數量越多，ATP的含量越高，發出的熒光越強[1，2]。手持式ATP熒光檢測儀就是基于ATP生物發光的原理，利用專門研制的熒光檢測儀和ATP涂抹拭子來捕捉和檢測發光值，以及測定樣本表面微生物污染程度的快速檢測設備，具有操作簡單、快速、適用范圍廣、攜帶方便、功耗低、對操作人員的專業技術水平要求低等優點[3-5]。本研究對潔凈度檢測系統進行檢測效果的驗證，分別從檢測靈敏度、線性、重復性和衰減率這4個方面進行。

1 材料

1.1 儀器與試劑

PureTrustTM智能熒光檢測儀，北京美正生物科技有限公司;ATP表面涂抹拭子，北京美正生物科技有限公司;ATP標準品（相對分子質量為507.18），SIGMA;無菌水，北京美正生物科技有限公司。

1.2 菌株

大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、酵母菌（ATCC 10231）。

1.3 標準溶液配制

ATP標準儲備溶液配制：準確稱取一定量ATP標準品于100mL容量瓶中，用無菌水溶解并定容，配制成濃度為1.77×10-8mol/L的腺苷-5'-三磷酸標準儲備溶液。用移液槍移取0.1mL ATP標準儲備溶液，加入0.9mL無菌超純水，制成濃度為1.77×10-9mol/L的ATP標準溶液，然后逐級稀釋成濃度為1.77×10-10、1.77×10-11、1.77×10-12mol/L……1.77×10-16mol/L的ATP標準工作溶液，置于-20℃冷凍，備用。

2 檢測方法

為確保檢測結果的準確性和可靠性，實驗過程需注意以下幾個方面。①實驗過程中，檢測人員必須佩帶手套和口罩，以此避免檢測人員自身攜帶的ATP對實驗結果造成影響;②拭子需冷藏放置，在使用之前需恢復至室溫;③取拭子時不能觸碰拭子頭或柄，以免造成污染;④振搖拭子時不能上下搖動;⑤在測量過程中要保持熒光儀垂直。ATP熒光檢測儀以相對光單位（relative light units，RLU）數值顯示結果，RLU值與檢測樣本中的ATP含量呈正比。

2.1 靈敏度及線性

2.1.1 ATP標準品檢測靈敏度

取濃度為1.77×10-10～1.77×10-15mol/L梯度的ATP標準溶液，從ATP表面涂抹拭子中取出棉簽，用移液槍準確移取20μL ATP標準工作溶液滴于棉簽頭上，然后將棉簽插回拭子管內并按下使其與底液接觸，將檢測管左右搖晃5～10s，充分混勻后，插入ATP檢測儀，等待30s后開始檢測。

2.1.2 菌體檢測靈敏度

在對菌體進行檢測時，選取較為常見的革蘭氏陽性細菌（大腸埃希氏菌）、革蘭氏陰性細菌（金黃色葡萄球菌）和真菌（酵母菌）這3種，檢測本產品對不同構造菌體的裂解及檢測能力。

2.1.2.1 大腸埃希氏菌

取濃度為1×108CFU/mL ATCC 25922新鮮菌液，稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度，從檢測管中取出棉簽，用移液槍準確移取20μL菌液滴于棉簽頭上，等待30s，然后將棉簽插回檢測管內并按下使其與底液接觸，將檢測管左右搖晃5～10s，充分混勻后，插入ATP熒光檢測儀，等待30s后開始檢測。將得到的熒光值與ATP濃度和菌液濃度進行線性分析，根據R2判斷其線性是否良好。

2.1.2.2 金黃色葡萄球菌

取濃度為4×108CFU/mL ATCC 6538新鮮菌液，稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度。從檢測管中取出棉簽，用移液槍準確移取20μL菌液滴于棉簽頭上，等待30s，然后將棉簽插回檢測管內并按下使其與底液接觸，將檢測管左右搖晃5～10s，充分混勻后，插入ATP檢測儀，等待30s后開始檢測。將得到的熒光值與ATP濃度和菌液濃度進行線性分析，根據R2判斷其線性是否良好。

2.1.2.3 酵母菌

取5×106CFU/mL ATCC 10231新鮮菌液，稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度，從檢測管中取出棉簽，用移液槍準確移取20μL菌液滴于棉簽頭上，等待30s，然后將棉簽插回檢測管內并按下使其與底液接觸，將檢測管左右搖晃5～10s，充分混勻后，插入ATP檢測儀，等待30s后開始檢測。將得到的熒光值與ATP濃度和菌液濃度進行線性分析，根據R2判斷其線性是否良好。

2.2 重復性

用移液槍準確移取20μL不同濃度的ATP標準品稀釋液（1.77x10-6mol/L濃度梯度和1.77x10-8mol/L濃度梯度）滴于棉簽頭上，然后將棉簽插回拭子管內并按下使其與底液接觸，左右搖晃5～10s，充分混勻后，將拭子插入ATP檢測儀，等待30s后開始檢測。重復測試10次，計算10次結果的相對標準偏差（RSD），相對標準偏差應小于15%。

2.3 衰減率

測定儀器在5min內的熒光值衰減率。選擇一個較高濃度ATP溶液（1.77x10-13mol/L）和一個較低濃度ATP溶液（1.77x10-15mol/L），各吸取20μL滴加至拭子棉簽上，測定反應發生后5min內的熒光衰減率，每隔一分鐘測定一次熒光值，衰減率應不超過25%。

3 結果與分析

3.1靈敏度

3.1.1 ATP標準品檢測靈敏度

本試驗選擇1.77×10-10～1.77×10-16mol/L的ATP標準溶液進行梯度實驗，測得的不同濃度ATP標準溶液檢測值如表1。

由表1可以看出，在1.77×10-10～1.77×10-16mol/L濃度范圍內，儀器測得的熒光值隨ATP濃度變化呈現明顯的梯度差異，檢測值隨ATP濃度降低而減小。由圖1可知，在1.77×10-10～1.77×10-16mol/L濃度范圍內，儀器所測得的熒光值不僅呈現出明顯的梯度差異，而且有較好的線性關系，線性方程為y=0.9589x+18.442（R?=0.9961）。所以，本系統可準確檢測濃度在1.77×10-10～1.77×10-16mol/L范圍內的標準ATP樣品，最低檢測限為1.77×10-15mol/L。

3.1.2 菌體檢測靈敏度及線性

3.1.2.1 大腸埃希氏菌

大腸埃希氏菌是革蘭氏陰性菌，本系統對大腸埃希氏菌的檢測結果如下：

由表2可以看出，在2×106至2000CFU范圍內，儀器測得的熒光值隨菌液量變化呈現明顯的梯度差異，檢測值隨菌量降低而減小。圖2表明，在一定范圍內，儀器測得的熒光值不僅有明顯的梯度差異，且有良好的線性關系，線性方程為y=1.0062x-0.9009（R?=0.9719）。所以，本拭子可以準確檢測CFU在2×106至2000范圍內的大腸桿菌，最低檢測限為2000CFU。

3.1.2.2 金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌，本系統對金黃色葡萄球菌的檢測結果如表3。

由表3可以看出，在8×106至800CFU范圍內，儀器測得的熒光值隨菌液量變化呈現明顯的梯度差異，檢測值隨菌量降低而減小。圖3表明，在一定范圍內，本儀器測得的熒光值與菌液濃度的線性關系較好，線性方程為y=1.0735x-2.079（R?=0.9969）。所以，本拭子可以準確檢測CFU在8×106至800范圍內的金黃色葡萄球菌，最低檢測限為800CFU。

3.1.2.3 酵母菌

酵母菌屬于真菌的一種，本系統對酵母菌的檢測結果如表4。

由表4可以看出，在105至10CFU范圍內，本系統測得的熒光值隨菌液量變化呈現明顯的梯度差異，檢測值隨菌量降低而減小。圖4表明，在一定范圍內，本儀器測得的熒光值與酵母菌液濃度的線性關系較好，線性方程為y=0.9046x+1.8542（R?=0.9916）。所以，本拭子可以準確檢測CFU在105至10CFU范圍內的酵母菌，最低檢測限為10CFU。

3.2 重復性驗證結果

選取ATP 1.77×10-13mol/L梯度和ATP 1.77×10-15mol/L梯度的標準溶液，測試拭子重復性，檢測結果如表5。

由表5可以看出，在較高濃度ATP（1.77×10-13mol/L）情況下，檢測10次，相對標準偏差為8%;在較低濃度ATP（1.77×10-15mol/L）情況下，檢測10次，相對標準偏差為13%，高濃度和低濃度ATP條件下的檢測重復性均小于15%。所以，本系統具有良好的可重復性和穩定性。

3.3 衰減率

使用ATP熒光法檢測潔凈度時，衰減率是一個重要指標——在ATP熒光反應中所生成的熒光容易發生降解，導致檢測的時效性和穩定性都受到較大影響。本研究對待測拭子進行了衰減率檢測，結果詳見表6。

由表6可知，濃度為1.77×10-13mol/L的ATP溶液在檢測第6min時，熒光值相比較最高熒光值是92%;濃度為1.77×10-15mol/L的ATP溶液在檢測第6min時，熒光值相比較最高熒光值是106%。兩次試驗的衰減率均遠小于25%，說明本系統具有良好的抗衰減能力，滿足ATP檢測要求。

4 討論

本研究對一種基于ATP熒光反應的潔凈度檢測系統的靈敏度、線性、重復性和衰減率進行了驗證，且驗證結果良好;該系統對ATP標準溶液的檢出限為1.77×10-15mol/L，線性良好。該系統對菌液的檢出結果為：大腸埃希氏菌檢出限2000CFU、金黃色葡萄球菌檢出限800CFU、酵母菌檢出限10CFU，均線性良好。同時，這一系統的重復性良好，在高濃度ATP下，重復檢測10次，相對標準偏差（RSD）為8%;低濃度ATP下，重復檢測10次，相對標準偏差為13%，均小于15%，滿足要求。此外，在6min內，熒光衰減率沒有明顯變化。以上結果表明，該潔凈度檢測系統的基本性能可滿足環境潔凈度檢測的要求。

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