miR-150在急性呼吸窘迫綜合征患者血清中的表達及臨床意義*

蔣萍萍，葉寧，徐寶靈(.桂林醫學院第二附屬醫院急診科，廣西桂林5400；.桂林醫學院附屬醫院急診科，廣西桂林 54000)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是急性肺損傷(ALI)的最終嚴重階段，病死率高達40%以上。因此，篩選出ARDS發病和預后的生物學標志物至關重要。微小RNA(microRNA，miRNA)是小的非編碼RNA，其表達失調可能參與許多疾病的發病機制。有學者證實，miRNAs在ARDS發病機制和進展過程中具有潛在的臨床應用價值[1]。另有研究表明，miRNA在ARDS炎癥反應中發揮著不可忽視的作用[2-3]。miR-150是定位于19q13.33，長度為2 nt的單鏈miRNA，miR-150通過直接靶向絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3(AKT3)表達，減輕脂多糖(LPS)誘導的急性肺損傷[4]。然而，miR-150在ARDS中發病機制中作用的文獻報道少見。本研究通過檢測ARDS患者血清中miR-150的表達水平，分析其表達的臨床意義，評估其篩查或預后預測價值。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集2018年1月至2019年11月于桂林醫學院第二附屬醫院急診科就診的ARDS患者50例，男31例，女19例；年齡(55.08±11.52)歲；BMI(23.25±2.27)kg/m2；APACHE Ⅱ評分(24.18±8.46)分。納入標準[5]：(1)符合ARDS診斷標準；(2)入住ICU時間>72 h。排除標準：(1)年齡<18歲；(2)自身免疫病患者；(3)急性肺疾病或者慢性阻塞性肺疾病患者；(4)腫瘤或伴有肝、腎等其他臟器功能障礙患者。選取同期體檢的50例體檢健康者作為健康人對照組，男32例，女18例；年齡(55.14±12.14)歲；BMI(23.42±2.12)kg/m2。兩組研究對象年齡、性別和BMI間差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究經桂林醫學院第二附屬醫院醫學倫理委員會批準(批準文號：2017GLMU1AYJS083)，患者及家屬均知情同意。

1.2標本采集 采集ARDS患者入院第1天(體檢健康者于體檢當日)的空腹靜脈血10 mL，置于生化采血管中，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離并收集血清，置于-80 ℃保存。

1.3主要儀器及試劑 MR-96A酶聯免疫檢測儀(武漢科爾達醫療科技公司)，CFX96實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，Microfuge 20R高速冷凍離心機(美國貝克曼公司)。miRNeasy Serum/Plasma Kit(德國Qiagen公司)，Prime Script RT試劑盒、Perfect Real time染料法實時熒光定量試劑盒(日本TaKaRa公司)，miR-150和U6擴增引物(上海生工公司)。

1.4RNA提取、逆轉錄反應 按照miRNeasy Serum/Plasma Kit說明書提取總RNA，采用紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度，取吸光度(A260/280 nm)值為1.8～2.0的樣本。按Prime Script RT試劑盒說明書將miRNA逆轉錄為cDNA，樣本置于-20 ℃保存。

1.5RT-qPCR檢測 根據NCBI中GenBank提供的miR-150(序列號：NC_000019.10)，U6(序列號：NC_000898.1)的基因序列，由上海生工公司設計并合成引物，引物信息見表1。將獲得的cDNA采用Perfect Real time染料法，按照實時熒光定量試劑盒說明書進行擴增，反應體系為20 μL，包括：2×SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 12 μL。循環參數：95 ℃變性30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共40個循環，在60 ℃時采集熒光信號，并用實時熒光定量PCR儀自帶的CFX96 Real-Time PCR Detection System軟件進行熔解曲線分析。以U6為內參照，并采用2-△△Ct法進行相對定量分析。

表1 引物序列信息

1.6統計學分析 數據均使用SPSS 24.0軟件包進行統計學分析。采用卡方檢驗分析血清中miR-150的表達水平與ARDS患者臨床病理參數的關聯。采用Pearson分析miR-150的表達與APACHE Ⅱ評分的相關性。Kaplan-Meier生存曲線進行生存分析。生存資料的多因素分析應用Cox回歸模型。根據ARDS組與健康人對照組血清miR-150的表達水平繪制ROC曲線，以評價血清miR-150用于評估ARDS的篩查價值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1ARDS患者血清中miR-150的表達水平比較 與健康人對照組(5.44±1.27)相比，ARDS患者血清中miR-150的表達水平(2.18±0.87)顯著降低(t=14.972，P<0.05)。

2.2ARDS患者臨床病理資料分析 以miR-150表達水平的平均數(2.18)為界值，將ARDS患者分為低表達組(n=27)和高表達組(n=23)，結果發現，miR-150低表達和APACHE Ⅱ評分有關(χ2=4.154，P=0.042)，而與患者年齡、性別、BMI以及吸煙史均無關(P>0.05)。見表2。

表2 ARDS患者臨床病理參數的比較

2.3ARDS患者血清miR-150表達水平與APACHE Ⅱ評分的相關性 Pearson分析結果顯示，ARDS患者血清miR-150的表達水平與APACHE Ⅱ評分呈負相關(r=-0.826，P<0.05)。進一步分析miR-150低表達組和高表達組與APACHE Ⅱ評分相關性，結果顯示，血清miR-150低表達組與APACHE Ⅱ評分呈負相關(r=-0.436，P<0.05)，而血清miR-150高表達組與APACHE Ⅱ評分無相關性(r=-0.299，P>0.05)。

2.4血清miR-150水平與ARDS患者生存期的關系 Kaplan-Meier生存曲線顯示，血清miR-150低表達ARDS患者的28 d生存率顯著低于高表達者(33.33% vs 82.61%，χ2=12.320，P<0.001)。見圖1。Cox回歸分析顯示，ARDS患者生存期與血清miR-150表達水平和APACHE Ⅱ評分均有關。見表3。

圖1 miR-150表達水平與ARDS患者生存期的關系

表3 多因素Cox回歸分析患者生存期的影響因素

2.5血清miR-150用于篩查ARDS的價值 根據ARDS組與健康人對照組血清miR-150的表達水平繪制ROC曲線。miR-150篩查ARDS的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.988(95%CI：0.975～1.000)，當cut-off值為3.36時，其敏感性和特異性分別為96%和88%。見圖2。

圖2 miR-150篩查ARDS的ROC曲線

3 討論

ARDS病因復雜，發病機制尚不明確，miRNA作為調控因子在ARDS的發病和預后中發揮重要作用[6]。近年來研究發現，miR-150在惡性腫瘤、系統性硬化病、肺動脈高血以及組織纖維化等多種疾病中呈異常表達[7]。本研究檢測ARDS患者血清中miR-150的表達，結果發現miR-150在ARDS患者血清中低表達，且與APACHE Ⅱ評分相關呈負相關。本研究與Wei等[8]研究結果相似，其結果亦證實，血液循環中的miR-150呈異常表達。APACHE Ⅱ評分系統由急性生理學評分(APS)、年齡評分、慢性健康狀況評分3個部分組成，可作為評估ICU患者病情和預后的指標[9]。筆者進一步采用Kaplan-Meier生存曲線分析，結果顯示，血清miR-150低表達的ARDS患者28 d生存率顯著低于血清miR-150高表達者。Cox回歸模型結果表明，ARDS患者生存期與血清miR-150表達水平以及APACHE Ⅱ評分相關，這與Li等[4]研究相一致，其結果表明，miR-150表達水平在ARDS患者的血清中顯著降低，并且與疾病嚴重程度和ARDS 28 d生存率呈負相關。提示miR-150水平與ARDS患者病情嚴重程度和預后具有一定的相關性，可作為患者預后的重要生物學標志物。

miRNA有望成為ARDS潛在的診斷指標和治療靶點。研究表明，miR-122高表達與ARDS患者病情嚴重程度及預后相關，且miR-122聯合APACHE Ⅱ評分對ARDS患者預后具有較高的評估價值[10]。本研究采用ROC曲線對血清miR-150篩查ARDS的價值進行分析，結果表明，miR-150篩查ARDS的AUCROC為0.988(95%CI：0.975～1.000)，敏感性和特異性分別為96%和88%。這與Gan等[11]研究結果一致，其研究表明髖部骨折后急性肺損傷(ALI)患者血清miR-150的表達明顯降低，進一步進行線性回歸分析結果顯示，血清miR-150與肺組織學得分顯著相關，且在髖部骨折后ALI患者的輔助診斷具有一定的價值。以上研究提示血液循環中的miR-150可能成為ARDS早期篩查及預后的生物學標志物。

綜上所述，miR-150在ARDS患者血清中低表達，并與APACHE Ⅱ評分以及預后相關，有望成為ARDS發病和預后預測的生物學標志物。但是本研究尚存一些不足：(1)樣本量較少，預后及篩查相關結果需通過擴大樣本量進行驗證并補充；(2)未進行連續動態監測miR-150的變化水平及療效評價；(3)本文缺乏相關作用機制研究，后期需通過體內動物實驗進行完善與補充。