哮喘患者IL-13基因Intron3+1923位點C/T、β2-AR基因R16G單核苷酸多態(tài)性及HLA等位基因頻率表達對外周血T淋巴細胞亞群和IgE的影響*

常永莉，張莉媛，王惠琴，王冰，陳方園，李天浩(陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西咸陽 712000)

細胞因子可調(diào)節(jié)細胞增殖、分化，其中白細胞介素-13(interleukin-13,IL-13)基因、β2腎上腺素能受體(β2 adrenergic receptor,β2-AR)基因、人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因在哮喘患者發(fā)病過程中具有重要意義[1]。IL-13基因Intron3+1923位點C/T多態(tài)性對IL-13的生物學(xué)活性具有調(diào)節(jié)作用[2]。Mohamed-Hussein等[3]指出，β2-AR功能低下可能是導(dǎo)致哮喘發(fā)病的重要機制。谷亞星等[4]認為，HLA基因在調(diào)節(jié)機體免疫方面具有重要作用，且對多種呼吸系統(tǒng)疾病具有易感性。因此，對上述基因多態(tài)性的研究已成為了哮喘遺傳學(xué)的研究熱點。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法(PCR-PFLP)對90例哮喘患者IL-13、β2-AR及HLA基因進行檢測，并測定其與T淋巴細胞亞群及免疫球蛋白E(IgE)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.2儀器與試劑 限制性內(nèi)切酶NIAⅣ、TaqDNA聚合酶、IgE酶標抗體、Trizol試劑(美國賽默飛世爾科技公司)，抗人CD3+、CD4+、CD8+單克隆抗體及IgG對照(北京同立海源生物科技公司)。Applied biosystems PCR熱循環(huán)儀(美國賽默飛世爾科技公司)，DNM-9602G酶聯(lián)儀(北京普朗新技術(shù)公司)，DYY-4C穩(wěn)壓穩(wěn)流定時電泳儀(上海滬粵明科學(xué)儀器公司)，BD流式細胞儀(昆山市賽特科學(xué)儀器公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集及DNA抽提 采集哮喘患者治療前及健康人對照組體檢時的晨起空腹靜脈血3 mL，477×g離心10 min。取血漿500 μL，置于-20 ℃保存，用以檢測血清IgE水平。其余部分抽提DNA。吸取細胞懸液至1.5 mL Ep管中，4 ℃、251×g離心5 min，棄上清液，按照Trizol試劑說明書操作抽提DNA，采用紫外分光光度計檢測DNA樣本，取吸光度(A260/280 nm)值在1.8～2.1的樣本用于后續(xù)試驗。樣本置-20 ℃保存。

1.3.2引物設(shè)計及PCR 根據(jù)GenBank收錄的IL-13、β2-AR、HLA基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，并由上海生工公司合成特異性引物，引物序列見表1。PCR擴增總體系為50 μL，包括基因組DNA 200 ng，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs各10 nmol，1. 5 U Taq DNA 聚合酶，10 pmol上、下游引物，具體擴增所需MgCl2濃度(IL-13和β2-ARR16G A/G均為1.5 μL，HLA為2.0 μL)，使用滅菌蒸餾水補充體積至50 μL。IL-13基因PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 變性2 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。β2-ARR16G A/G基因PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，66 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。HLA基因PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃變性 5 min；55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取3 μL PCR擴增產(chǎn)物，采用Applied biosystems PCR熱循環(huán)儀檢測(220 V電壓，電泳20 min)，30 g/L瓊脂糖凝膠電泳并觀察。

表1 PCR引物序列及產(chǎn)物片段大小

1.3.3PCR-PFLP 取PCR產(chǎn)物10 μL，37 ℃酶切過夜。在30 g/L瓊脂糖凝膠中加溴化乙錠(0.7 mg/L)，取8 μL酶切產(chǎn)物上樣電泳凝膠，紫外分光光度計下觀察。IL-13基因型CC位點存在BsaAI位點，酶切產(chǎn)物為310 bp、249 bp，CT基因型出現(xiàn)酶切點，酶切產(chǎn)物為559 bp、310 bp、249 bp，而TT基因未出現(xiàn)酶切點。β2-ARR16G基因酶切后A/A基因型為168 bp，G/G基因型為150 bp+18 bp，A/G雜合子基因型為168 bp+150 bp+18 bp。

1.3.4流式細胞術(shù)檢測T淋巴細胞亞群 取各組患者靜脈血3 mL，經(jīng)EDTA-K2抗凝后，取100 μL加入試管，依次加入抗人CD3+、CD4+、CD8+單克隆抗體20 μL，取另一管加入MsIgG1-RD1/MsIgG2-FITC各20 μL作為陰性對照管，避光靜置30 min。加入0.2 mL溶血劑后進行10倍稀釋，靜置5 min，240×g離心5 min后棄上清液。加入2 mL PBS洗滌2次，240×g離心5 min。加入1%多聚甲醛0.3 mL，采用BD流式細胞儀檢測。以CD3+、CD4+、CD8+陽性率≥0.1%為陽性表達。

1.3.5ELISA法檢測血清IgE 取上述2組患者的血清樣本，復(fù)溫后按照ELISA試劑盒及DNM-9602G酶聯(lián)儀說明書操作檢測IgE水平。IgE參考范圍<85 KU/L。

2 結(jié)果

2.1IL-13、β2-AR、HLA基因頻率在2組中的分布 疾病組患者IL-13基因Intron3+1923位點TT、TC基因型頻率、β2-ARR16G基因位點AA基因型頻率、HLA基因0401、0601等位基因頻率較健康人對照組均顯著升高(P<0.05)。而IL-13基因Intron3+1923位點CC基因型頻率較健康人對照組顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 2組IL-13、β2-AR、HLA基因不同基因型頻率[n(%)]

2.2IL-13、β2-AR、HLA不同基因型對T淋巴細胞亞群及血清IgE水平的影響IL-13TT、TC，β2-ARAA，HLA0401、0601基因型患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+較IL-13CC，β2-ARGG、AG，HLA0101/0102、0103、0501基因型患者顯著降低，而血清IgE水平較IL-13CC、GG，β2-ARAG，HLA0101/0102、0103、0501基因型顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 IL-13基因不同基因型患者T淋巴細胞及IgE的水平

3 討論

既往的研究僅針對單一基因位點進行相關(guān)性分析，對多個基因位點研究報道較少，考慮到IL-13、β2-AR、HLA基因多態(tài)性在哮喘患者進展過程中具有重要的臨床意義，本研究使用PCR-PFLP法進行基因多態(tài)性分析，并對其與患者T淋巴細胞亞群及IgE水平關(guān)系進行探討。

本研究結(jié)果顯示，哮喘患者IL-13基因Intron3+1923位點共出現(xiàn)CC、TT、TC 3種基因型，其中患者TT、TC基因型頻率顯著高于健康人對照組(P<0.05)，表明哮喘患者T等位基因頻率分布高于健康人對照組，C等位基因顯著低于健康人對照組，提示IL-13基因Intron3+1923位點上的T等位基因可能是哮喘的易感基因，而C等位基因可能是哮喘患者的抵抗基因。因此，具有T等位基因的人群可能因為長期生活在污染嚴重或過敏原較多的環(huán)境中，哮喘發(fā)病率明顯增加[6]。此外，β2-ARR16G單核苷酸多態(tài)性(SNP)共出現(xiàn)AA、GG、AG 3種基因型，AA基因型頻率高于健康人對照組(P<0.05)。AA屬純合子基因型，提示純合子基因型與哮喘發(fā)作有一定關(guān)聯(lián)。劉曉華等[7]研究證實，β2-ARR16G中AA基因型與哮喘具有一定相關(guān)性，急性期和緩解期β2-ARR16G 16位點的分布基因頻率中精氨酸/精氨酸分別為17.7%和23.5%，精氨酸/甘氨酸為67.7%和66.2%，甘氨酸/甘氨酸為14.5%和10.3%，27位點分布基因頻率中谷氨酰胺/谷氨酰胺為80.6%和75.0%，谷氨酰胺/谷氨酸為12.9%和17.6%，谷氨酸/谷氨酸為6.5%和7.4%，二者在2個位點上基因型存在差異，與本研究結(jié)果相一致。HLA等位基因共出現(xiàn)0101/0102、0103、0401、0601、0501基因型，HLA0401、0601基因型頻率均高于健康人對照組(P<0.05)，提示0401、0601基因型可對哮喘產(chǎn)生影響。有學(xué)者證實，IL-13水平過高可誘導(dǎo)患者體內(nèi)B細胞合成IgE，導(dǎo)致患者出現(xiàn)免疫功能紊亂，出現(xiàn)T淋巴細胞亞群失衡[8]。本研究中TT、TC、AA、0401、0601型患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均低于其余基因型患者，而血清IgE水平高于其余基因型患者，提示IL-13基因攜帶T基因型、β2-AR基因AA純合子基因型、HLA0401、0601等位基因可能具有協(xié)同作用。

通過研究IL-13、β2-AR、HLA基因位點突變導(dǎo)致哮喘進展，引起T淋巴細胞亞群、IgE表達失衡，筆者認為IL-13、β2-AR、HLA基因表達水平異常及基因多態(tài)性可導(dǎo)致機體出現(xiàn)TH1/TH2失衡，IL-13表達水平增加，大量作用于B細胞，從而加重體內(nèi)炎癥反應(yīng)。Reich等[9]指出，IgE可調(diào)節(jié)嚴重特應(yīng)性皮炎患者皮膚組織中IL-13的表達，與本研究結(jié)果相一致。同時，IL-13基因可直接促進IgE細胞因子合成，β2-AR、HLA基因可轉(zhuǎn)導(dǎo)相似信號[10]。雖然β2-AR、HLA基因與IL-13之間的作用機理目前尚不清楚，但IL-13可誘導(dǎo)MHC Ⅱ類分子及CD23表達，抑制嗜酸性粒細胞凋亡，誘導(dǎo)β2-AR及HLA-DR表達，促進T細胞活化。本研究僅證實IL-13基因攜帶T基因型、β2-AR基因AA純合子基因型、HLA0401、0601等位基因與哮喘患者存在一定關(guān)系，但在地域、人種之間的區(qū)別及如何形成遺傳易感性機制，還需進一步研究。本研究今后將增加樣本量，并對患者病情嚴重程度及家族史進行分析，從而為預(yù)防、診治哮喘提供實驗依據(jù)。