老年性白內障與MTHFR基因、同型半胱氨酸及B族維生素的相關性

羅軍,楊渝偉(綿陽市中心醫院檢驗科，四川綿陽 635000)

隨著人口老年化，老年性白內障成為全球視力損害乃至致盲的首要原因[1]。大量研究證實，蛋氨酸代謝對維持晶狀體透明度十分重要，尤其是代謝過程中亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)及其產物——同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)與老年性白內障密切相關[2]。HCY代謝副產物——同型半胱氨酸硫內酯可引起晶狀體蛋白發生N-同型半胱氨酸化，從而引起結構和溶解度改變，最終導致白內障[3]。最近研究發現，MTHFRC677T單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)可嚴重影響MTHFR酶活性，進而影響HCY和葉酸(folic acid, FOL)的代謝[4]。然而，目前MTHFR基因多態性與老年性白內障的研究報道少見。因此，本研究納入MTHFR酶的重要代謝物質——維生素B12(vitamin B12, VitB12)、VitB6、FOL和HCY，重點評估MTHFR基因多態性與老年性白內障的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年1月至2020年6月綿陽市中心醫院就診的663例老年性白內障患者作為疾病組，其中男312例，女351例，年齡51～88歲，中位年齡69歲。并于同期隨機選擇646例體檢健康者作為健康人對照組，其中男308例，女338例，年齡50～93歲，中位年齡67歲。受試者均按照國際指南診斷標準[5]進行眼科檢查，包括視力、裂隙燈和眼底檢查。納入標準：漢族；年齡50歲以上；視力<0.7；老年性白內障患者晶狀體發生變性和渾濁，但無其他眼科疾病；健康人對照無白內障癥狀和體征，以及其他眼科疾病。排除標準：嚴重的肝腎疾病、冠心病、糖尿病、風濕性疾病、癌癥及腦血管疾病等，以及服用抗癲癇藥物、免疫抑制劑等導致HCY增高的藥物。兩組間的年齡(t=0.818,P=0.414)及性別(χ2=0.050,P=0.823)差異無統計學意義。本研究經綿陽市中心醫院醫學倫理委員會審批(批準文號：S-2018-085)，各研究對象均知情同意。

1.2儀器與試劑 QuantStudio實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，Cobas 6000全自動生化分析儀(德國羅氏公司)，ARCHITECT i2000化學發光免疫分析儀及配套試劑(美國雅培公司)，EXT 9050MD超高效液相色譜串聯質譜檢測系統及配套試劑(濟南英盛生物公司)，EDTA-K2和SSTTM ⅡAdvance真空采血管(美國BD公司)，MTHFRC677T基因型檢測試劑盒(西安金磁納米生物公司)，HCY檢測試劑盒(四川邁克生物公司)。

1.3方法

1.3.1樣本采集 所有受試對象(體檢健康者于體檢時)均在治療前，于清晨空腹狀態下，分別用EDTA-K2和SSTTM ⅡAdvance真空采血管采集靜脈血2.0 mL和5.0 mL，充分混勻。EDTA-K2管內的全血樣本用于MTHFRC677T基因型檢測，若不能及時檢測,置于2～8 ℃保存不超過7 d；SSTTM ⅡAdvance真空采血管靜置約30 min，2 000×g離心10 min，分離血清，在4 h內完成HCY、FOL、VitB12和VitB6檢測。

1.3.2MTHFRC677T基因型檢測 采用地高辛標記PCR-抗地高辛標記金磁微粒層析法，嚴格按照試劑說明書進行檢測。結果判讀標準：等位基因C和T分別擴增，擴增產物通過地高辛-抗地高辛結合，或與金磁微粒結合，然后在2個獨立的層析系統中進行層析，根據檢測線是否出現條帶，判讀C677T位點的基因型。若僅等位基因C層析系統出現條帶，則為CC基因型；若僅等位基因T層析系統出現條帶，則為TT基因型；若等位基因C和T層析系統均出現條帶，則為CT基因型。

1.3.3血清各指標檢測方法 血清HCY測定采用同型半胱氨酸甲基轉移酶/S-腺苷同型半胱氨酸水解酶循環法，用Cobas 6000全自動生化分析儀檢測；血清FOL測定采用釕標葉酸結合蛋白競爭法，用ARCHITECT i2000化學發光免疫分析儀檢測；血清VitB12和VitB6測定采用質譜分析法，用EXT 9050MD超高效液相色譜串聯質譜檢測系統檢測。所有項目均嚴格按照操作說明書進行。參考范圍：HCY≤15 μmol/L；FOL：3.1～20.5 ng/mL；VitB12：0.1～2.1 ng/mL；VitB6：2～25 ng/mL。

1.4統計學分析 采用SPSS 19.0和MedCalc醫學統計軟件進行統計學分析。計量資料以中位數(四分位數)[M(P25,P75)]表示，組間比較采用Mann-Whitney秩和檢驗，多組獨立樣本的比較采用單因素方差分析，采用Jonckheere-Terpstra趨勢分析各指標與不同基因型的相關性，用多元Logistic回歸分析基因型或老年性白內障的風險因素；計數資料用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1疾病組與健康人對照組MTHFR單核苷酸多態性的比較MTHFRC677T位點TT、CT和CC基因型的分布頻率在疾病組中分別為23.08%(153/663)、52.34%(347/663)、24.58%(163/663)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=0.773，P=0.679)；在健康人對照組中分別為16.10%(104/646)、46.90%(303/646)、37.00%(239/646)，亦符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=0.122，P=0.941)；但兩組間CC(χ2=10.094,P=0.002)、CT(χ2=3.870,P=0.049)和TT(χ2=23.701,P<0.001)基因型分布頻率的差異具有統計學意義。此外，C667T突變率在疾病組和健康人對照組中分別為49.25%(653/1 326)和39.55%(511/1 292)，兩組間差異具有統計學意義(χ2=24.910,P<0.001)。

2.2疾病組與健康人對照組血清HCY、FOL、VitB12和VitB6水平比較 經Mann-Whitney檢驗，疾病組HCY水平顯著高于健康人對照組(P<0.001)，而FOL、VitB12和VitB6顯著低于健康人對照組(P<0.001)。見表1。然而，在兩組內部進行不同性別之間的差異分析，結果發現在健康人對照組中上述4項指標水平均無性別差異(P均>0.05)，在疾病組中除VitB6(Z=1.134,P=0.257)外，男性患者HCY水平明顯升高(Z=9.882,P<0.001)，而FOL和VitB12水平下降明顯(Z分別為-5.624和-6.968,P均<0.001)。見表2。

表1 兩組血清HCY、FOL、VitB12和VitB6水平比較[M(P25,P75)]

表2 兩組血清HCY、葉酸、VitB12和VitB6水平的性別差異比較[M(P25,P75)]

2.3不同MTHFR基因型亞組間血清HCY、FOL、VitB12和VitB6水平比較 分別將所有受試者、健康人對照組和疾病組，按不同MTHFR基因型分成3個亞組，采用Jonckheere-Terpstra趨勢分析HCY、FOL、VitB12和VitB6水平的變化趨勢。結果發現，隨著MTHFRC677T突變數增加(即CC→CT→TT)，無論是所有受試者，還是健康人對照組或疾病組，HCY水平均逐漸增加(Z分別為11.856、7.653和8.266，P均<0.001)，而FOL(Z分別為-8.443、-5.212和-10.634，P均<0.01)和VitB12(Z分別為-2.935、-2.226和-3.069，P均<0.01)水平均逐漸降低。見表3。

表3 不同MTHFR基因型亞組血清HCY、FOL、VitB12和VitB6水平比較

進一步進行多重比較發現，在所有受試者、健康人對照組和疾病組中，受試者TT基因型HCY(Z分別為13.322、8.169和8.559，P均<0.001)顯著高于CT基因型，而FOL(Z分別為-6.683、-4.126和8.670，P均<0.001)和VitB12(Z分別為-3.251、-2.490和3.468，P均<0.001)顯著低于CT基因型；但在CT基因型受試者中，HCY(Z分別為7.586、5.044和5.666，P均<0.001)高于CC基因型，FOL(Z分別為-6.302、-3.891和7.694，P均<0.001)低于CC基因型，而VitB12變化不顯著(P均>0.05)。

2.4各觀察指標與MTHFR基因突變和疾病發生的風險分析 經多元Logistic回歸分析，對于MTHFR基因突變和老年性白內障，HCY(OR分別為1.18和1.24,P均<0.001)是危險因素，FOL(OR分別為0.91和0.95,P均<0.001)是保護因素；而VitB12水平與MTHFR基因突變無關聯，卻是老年性白內障的保護因素(OR=0.86,P=0.001)。校正年齡和性別后，結果與之類似；并且相比CC型，CT型和TT型受試者患老年性白內障風險增加(校正前：OR分別為1.68和1.84,P均<0.01；校正后：OR分別為1.62和1.76，P均<0.01)。見表4。

表4 MTHFR基因突變和疾病發生的多元Logistic回歸分析

3 討論

老年性白內障是一種多因素相互作用的疾病。據哈佛大學一項對4 500萬人24年跟蹤調查報道表明，年齡是老年性白內障的決定性影響因素，而環境和遺傳因素則是主要的致病誘因[6]。此外，環境因素，如高強度的紫外線，太亮、太暗、炫光、反光的周圍環境，以及密閉工作環境內化學毒物的影響，均可導致年齡相關性白內障發病時間提前。近年來研究發現，遺傳因素與年齡相關性白內障密切相關，如著色性干皮病基因D、8-氧鳥嘌呤糖基酶-1基因和MTHFR基因多態性[7-8]。但迄今為止，國內外相關報道較少，且尚存爭議。有學者認為MTHFRC677T多態性的CC和TT基因型具有保護作用[8]；但也有學者認為，MTHFRC677T多態性的CT/TT基因型與皮質性白內障風險增加獨立相關[9]。本次試驗發現，老年性白內障患者MTHFRC677T等位基因中，TT型和CT型均明顯高于健康人對照；此外，相比CC型患者，CT型和TT型患者老年性白內障風險明顯增加。

本研究首先探討了MTHFR基因多態性與FOL/HCY代謝的關系。MTHFR所編碼的酶是FOL/HCY代謝中的關鍵酶[10]，其C677T基因多態性是指其677位點發生C(胞嘧啶)→T(胸腺嘧啶)突變。既往研究證實，此突變可導致其編碼酶的活性和熱穩定性下降[11]。受酶活性改變的影響，FOL/HCY代謝過程中相關物質的血清水平也將隨之改變，主要包括VitB12、VitB6、FOL和HCY。本研究結果證實，MTHFRC677T基因突變與HCY及FOL水平有關，而VitB12和VitB6水平所受影響較小。表明MTHFRC677T突變導致了MTHFR所編碼酶活性降低，引起HCY在體內積聚，進而發生高同型半胱氨酸血癥；而FOL作為HCY代謝的重要底物，則因高同型半胱氨酸血癥而消耗增加，呈現出FOL水平降低。至于同樣參與了FOL/HCY代謝的VitB12和VitB6，本試驗結果顯示，二者降低均與MTHFRC677T基因突變無明顯的關聯，分析原因可能與其血液中含量較低，從而受到的影響較小，或者經食物補充和腸道吸收功能代償等原因有關。此外，本研究還發現一些不同于既往報道[12]的FOL/HCY代謝特點，如老年性白內障患者血清VitB12和VitB6水平低于健康人對照，分析原因可能存在地域和飲食習慣差異；男性患者HCY水平顯著高于女性患者，這可能與男性吸煙、過量飲酒等有關[13]。

本次試驗在探討MTHFR基因多態性與老年性白內障的關系的同時，還納入了FOL/HCY代謝過程中的重要代謝物質作為影響因素。大量文獻報道表明，FOL/HCY代謝與白內障關系密切。有學者發現，HCY可誘導內質網應激壓力，引起細胞內質網穩態失衡和晶狀體上皮細胞中活性氧產生，導致晶狀體損傷[13]。另有研究證實，FOL可減輕HCY引起的氧化應激作用，減輕晶狀體損傷[14]。本研究經多元Logistic回歸分析證實，FOL/HCY代謝也與老年性白內障顯著相關，其中HCY是引起老年性白內障的危險因素，而FOL和VitB12則是保護因素，這與國內外研究報道一致[13,15]。同時，本研究結果還顯示，即使在校正了年齡、性別以及FOL/HCY代謝過程中的重要代謝物質的影響后，MTHFR基因多態性仍然是老年性白內障的潛在危險因素。國外研究報道，CT/TT基因型白內障患者中，僅33%歸因于MTHFR基因多態性所致HCY升高的間接途徑，而67%則歸因于該基因多態性的直接遺傳途徑[9]。因此，建議在對老年人進行眼睛保健時，可納入MTHFRC677T基因多態性檢測，以識別白內障的發生風險。

盡管本研究證實MTHFRC677T基因多態性可能與老年性白內障有關，但本研究尚存在一定的局限性。例如，在本次試驗過程中，所有環境因素(如紫外線照射、光照及毒物的影響等)難以評估而均未納入，結果是否受到環境因素影響并未評估；除VitB12和VitB6外，其他營養物質(如維生素A、C、D、E和K1等)均已證實與年齡相關性白內障有關[12]，但受檢測限制未納入。因此，有必要進一步深入探討。

綜上所述，MTHFRC677T CT/TT基因型患者發生老年性白內障的風險增加，同時受MTHFR基因編碼的酶活性降低的影響，HCY、FOL和VitB12水平改變均與老年性白內障的進展相關。因此，應常規將MTHFRC677T基因型檢測納入眼科保健項目，以判斷白內障的發生風險；同時定期檢測血清中HCY、FOL和VitB12水平，及時采取補充B族維生素、甜菜堿和N-乙酰半胱氨酸[8]等預防和治療措施，可能有助于延緩老年性白內障的發生、發展。