血漿Septin9基因甲基化檢測在胃腸道病變中的臨床應(yīng)用價值評價

王炳龍，湯紀(jì)豐，俞子晴，江仁權(quán)，何毓玨，林錦驃，歐啟水(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，福建醫(yī)科大學(xué)基因診斷研究中心，福建省檢驗醫(yī)學(xué)重點實驗室，福州 350005)

血漿甲基化Septin9基因(methylatedSeptin9, mSeptin9)檢測是近年來開展的檢驗項目，在臨床實踐中主要作為一種無創(chuàng)輔助診斷結(jié)直腸癌的方法。作為一種表觀遺傳的修飾形式，mSeptin9已被證實與多種腫瘤有關(guān)[1]，特別是在結(jié)直腸癌和胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中關(guān)系密切[2]。然而，mSeptin9基因在許多良性病變中也可被檢出，其在許多疾病中的病理機制和臨床應(yīng)用價值有待進一步明確。本研究通過回顧性收集2017年5月至2020年11月本院就診的消化系統(tǒng)惡性腫瘤和良性病變(主要為胃腸道病變)患者檢測血漿Septin9甲基化的病例信息，分析血漿Septin9基因甲基化檢測的臨床應(yīng)用價值，以期為進一步指導(dǎo)臨床實踐，探討mSeptin9的潛在致病機制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象 回顧性收集2017年5月至2020年11月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科檢測血漿Septin9基因甲基化的所有病例，經(jīng)篩選納入診斷為消化系統(tǒng)疾病的患者共2 067例，其中包括1 751例消化系統(tǒng)惡性腫瘤患者(1 276例惡性腫瘤根治術(shù)術(shù)前的患者和475例術(shù)后7 d內(nèi)的結(jié)直腸癌和胃癌患者)以及316例消化系統(tǒng)良性病變患者(主要包括結(jié)直腸炎35例、結(jié)直腸息肉56例、腸梗阻29例和胃炎107例等，其診斷均符合相應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，病理結(jié)果排除惡性病變)，另納入20例非消化系統(tǒng)良性病變患者(病理結(jié)果排除惡性病變，同時未有證據(jù)表明存在消化系統(tǒng)疾病)和41例無疾病證據(jù)受檢者作為對照組，同時收集所有納入者的相關(guān)臨床資料。其中，男性1 339例，女性789例；年齡13～93歲，中位年齡62歲。單因素回歸分析顯示，各組之間性別構(gòu)成對Septin9甲基化的檢測結(jié)果無影響(P>0.05)，除消化系統(tǒng)良性病變患者(OR=1.037 9，95%CI：1.012 3～1.064 1，P=0.002)和術(shù)后結(jié)直腸癌和胃癌患者(OR=1.027 9，95%CI：1.008 9～1.047 3，P=0.003 1)外，各組年齡對Septin9甲基化檢測結(jié)果無影響(P>0.05)。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有疾病的診斷均經(jīng)病理確診且符合相應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)均為原發(fā)性腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他原發(fā)性惡性腫瘤患者；(2)懷孕或哺乳期女性；(3)自身免疫病患者；(4)合并人免疫缺陷病毒感染者。本研究經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：閩醫(yī)大附一倫理醫(yī)技審[2015]084號及閩醫(yī)大附一倫理醫(yī)技審[2015]084-1號)，各研究對象知情同意。

1.2主要儀器及試劑Septin9基因甲基化檢測試劑盒(PCR熒光定量法，北京博爾誠科技公司)，QuantStudio DX實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，羅氏E801電化學(xué)發(fā)光儀(瑞士羅氏公司)。癌胚抗原(CEA)測定試劑盒、糖類抗原(CA)125檢測試劑盒、CA 72-4測定試劑盒、CA 19-9測定試劑盒、甲胎蛋白(AFP)檢測試劑盒(電化學(xué)發(fā)光法，瑞士羅氏公司)。

1.3標(biāo)本采集 術(shù)前患者于住院第一天采集，術(shù)后患者于手術(shù)后7 d內(nèi)采集，無疾病證據(jù)受檢者為體檢人群體檢時采集。檢測時采集晨起空腹(禁食8～12 h)靜脈血10 mL，EDTA-K2抗凝，1 350×g離心12 min，重復(fù)1次，獲取3.5 mL血漿；同時另采集靜脈血2 mL，促凝膠促凝，2 800×g離心8 min，獲取2 mL血清。

1.4血漿Septin9基因甲基化檢測 所有檢測均在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科完成。取上述血漿標(biāo)本，按照Septin9基因甲基化檢測試劑盒(PCR熒光探針法)說明書操作。步驟如下：(1)獲取3.5 mL血漿后，對血漿進行裂解、磁珠富集DNA、洗滌、洗脫DNA，將提取的DNA使用亞硫酸鹽進行轉(zhuǎn)化；(2)將轉(zhuǎn)化成功后的DNA加入PCR預(yù)反應(yīng)液(含dNTPs、10×PCR Buffer、引物、探針、阻斷劑以及Taq DNA聚合酶，單個反應(yīng)的反應(yīng)體系為60 μL，其中30 μL PCR預(yù)反應(yīng)液和30 μL DNA樣本)中進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件:94 ℃活化20 min；62 ℃ 5 s，55.5 ℃ 35 s，93 ℃ 30 s，45次循環(huán);40 ℃ 5 s。結(jié)果判斷：在內(nèi)參基因β-肌動蛋白(β-actin)結(jié)果正常的情況下，Ct值≤41.0時結(jié)果判為陽性，Ct值>41.0或無Ct值時結(jié)果判為陰性。每次實驗均設(shè)陽性和陰性對照，陽性和陰性對照均由試劑盒提供，處理方法及流程與受檢者相同。

1.5CEA、AFP、CA19-9、CA12-5和CA72-4檢測 采用電化學(xué)發(fā)光法，取上述血清標(biāo)本按照羅氏E801全自動電化學(xué)發(fā)光儀及配套的試劑盒說明書操作。CEA參考范圍為0～5.2 ng/mL(吸煙者0～6.5 ng/mL)；AFP參考范圍為0～13.6 ng/mL；CA19-9參考范圍為0～34 U/mL；CA12-5參考范圍為0～35 U/mL;CA72-4參考范圍為0～6.9 U/mL。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)的分析使用SPSS 20.0軟件、MedCalc軟件和SPSSAU 20.0 在線工具進行。對計數(shù)資料比較采用列聯(lián)表χ2檢驗或Fisher確切概率法；對有等級的計數(shù)資料采用Ridit分析；使用單因素Logistic回歸分析判斷年齡和性別對血漿Septin9基因甲基化檢測結(jié)果是否有影響；繪制ROC曲線分析血漿Septin9基因甲基化檢測的診斷價值，多因素Logistic回歸分析篩選聯(lián)合診斷指標(biāo)并計算預(yù)測概率。所有假設(shè)檢驗比較均為雙側(cè)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1血漿Septin9基因甲基化在各組中的表達(dá)水平 在所有未經(jīng)手術(shù)治療的病例中，消化系統(tǒng)惡性腫瘤患者共1 276例，占總病例的77.19%。在消化系統(tǒng)惡性腫瘤組和相應(yīng)部位良性病變組血漿Septin9基因甲基化檢測陽性率的比較中，胃癌(共302例，陽性檢出132例，陽性率43.71%)、肝癌(共9例，陽性檢出7例，陽性率77.78%)和結(jié)直腸癌組(共928例，陽性檢出536例，陽性率57.76%)的陽性率均高于相應(yīng)部位的良性病變組(P<0.01)。在消化系統(tǒng)疾病組和無疾病證據(jù)受檢者組(共41例，陽性檢出2例，陽性率4.88%)Septin9基因甲基化檢測陽性率的比較中，胃癌、肝癌、胰腺癌(共5例，陽性檢出3例，陽性率60.00%)、回盲部惡性腫瘤(共10例，陽性檢出7例，陽性率70.00%)、結(jié)直腸癌、腸梗阻(共29例，陽性檢出8例，陽性率27.59%)和結(jié)直腸息肉組(共56例，陽性檢出12例，陽性率21.43%)的陽性率均增高(P<0.05)。見表1。

表1 血漿Septin9基因甲基化在各組受檢者中的檢測結(jié)果分析

2.2血漿Septin9基因甲基化檢測結(jié)果與患者的臨床病理參數(shù)關(guān)系 收集經(jīng)病理確診的結(jié)直腸癌和胃癌患者，分析血漿Septin9基因甲基化檢測結(jié)果與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果見表2。在結(jié)直腸癌患者中，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、存在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者血漿Septin9基因甲基化陽性率較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而不同年齡、性別、分化程度、病理分型和腫瘤位置的患者在血漿Septin9基因甲基化的陽性率比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在胃癌患者中，Ⅲ～Ⅳ期和存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者血漿Septin9基因甲基化陽性率較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；而不同年齡、性別、分化程度、病理分型、腫瘤位置及是否存在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對胃癌中血漿Septin9基因甲基化陽性率的比較均無影響(P>0.05)。

表2 血漿Septin9基因甲基化檢測結(jié)果與結(jié)直腸癌和胃癌患者的臨床病理參數(shù)關(guān)系

2.3血漿Septin9基因甲基化檢測在結(jié)直腸癌和胃癌中的ROC曲線分析 繪制ROC曲線并對結(jié)直腸癌組與結(jié)直腸良性病變組或無疾病證據(jù)受檢者組，胃癌組與胃良性病變組或無疾病證據(jù)受檢者組逐一進行分析，結(jié)果顯示血漿Septin9基因甲基化檢測在以上各組中的ROC曲線下面積(AUCROC)分別為0.681、0.764、0.649和0.694，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3、圖1A。同時，血漿Septin9基因甲基化在結(jié)直腸癌和胃癌中與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物CEA、AFP、CA19-9、CA12-5、CA72-4陽性率的比較中，其陽性率均高于其他腫瘤標(biāo)志物(P<0.01)。見表4。聯(lián)合指標(biāo)ROC曲線分析表明，在結(jié)直腸癌與結(jié)直腸良性病變組中，Septin9聯(lián)合CEA檢測能將AUCROC提高至0.789(P<0.01)，并將敏感性提高至70.88%。見表3、圖1B。胃癌組中未發(fā)現(xiàn)聯(lián)合其他診斷指標(biāo)能改善血漿Septin9基因甲基化檢測的診斷價值(P>0.05)。

表3 血漿Septin9基因甲基化檢測在不同組別中的診斷價值

圖1 血漿Septin9基因甲基化檢測在結(jié)直腸癌和胃癌中的ROC曲線分析

表4 血漿Septin9基因甲基化與多種腫瘤標(biāo)志物陽性率的比較

2.4結(jié)直腸癌和胃癌患者手術(shù)前后血漿Septin9基因甲基化檢測陽性率的比較 分別比較928例惡性腫瘤根治術(shù)術(shù)前行血漿Septin9基因甲基化檢測與318例術(shù)后7 d內(nèi)行該檢測的結(jié)直腸癌患者、302例術(shù)前行該檢測與157例術(shù)后行該檢測的胃癌患者的陽性率，結(jié)果顯示各組術(shù)后血漿Septin9基因甲基化的陽性率(結(jié)直腸癌31.45%，胃癌33.76%)均低于術(shù)前(結(jié)直腸癌57.76%，胃癌43.71%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。同時，收集所有術(shù)前檢測結(jié)果為陽性且術(shù)后半年內(nèi)又行該檢測的患者資料作進一步分析，結(jié)果表明，在結(jié)直腸癌和胃癌患者中術(shù)后血漿Septin9基因甲基化的陽轉(zhuǎn)陰率分別為63.33%和69.23%，且存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的轉(zhuǎn)陰率明顯低于未轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表6。

表5 結(jié)直腸癌和胃癌患者手術(shù)前后血漿Septin9基因甲基化檢測結(jié)果的比較

表6 血漿Septin9基因甲基化檢測陽性的結(jié)直腸癌和胃癌患者手術(shù)前后檢測結(jié)果的比較

3 討論

Septin9基因的異常調(diào)節(jié)和改變參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。該基因的異常甲基化已成為多種腫瘤的重要生物學(xué)特征，對Septin9甲基化狀態(tài)的測定亦已用于多種腫瘤的診斷[3]。在臨床實踐中，Septin9基因甲基化檢測已廣泛開展，但其診斷價值在不同的研究中存在差異[4]。因此，本研究擬通過大樣本回顧性分析血漿Septin9基因甲基化檢測在消化道病變中的診斷價值，為臨床提供參考。

我們的回顧性研究表明，血漿Septin9基因甲基化在術(shù)前結(jié)直腸癌患者中陽性檢出率為57.67%，這與冷霞等[5]報道的52.10%陽性率以及與張春燕等[6]報道的62.50%陽性率基本一致，但低于趙媛等[4]報道的70%～90%陽性率。在術(shù)前胃癌患者中該檢測陽性率為43.70%，接近賀娜等[7]報道的46.90%陽性率和褚文慧等[8]報道的40.52%陽性率。同時，本研究結(jié)果顯示血漿Septin9基因甲基化在結(jié)直腸癌和胃癌中的檢驗效能均高于CEA、CA19-9和CA12-5等腫瘤標(biāo)志物。比較各研究的差異發(fā)現(xiàn)，本研究中使用的檢測方法和患者納入標(biāo)準(zhǔn)與冷霞等[5]十分相似。與其他研究者在陽性檢出率上的差異可能源于標(biāo)本來源、檢測方法、患者的治療情況以及樣本量大小的不同。相較其他研究，本研究的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在統(tǒng)計的樣本數(shù)量更大以及更接近患者在臨床實踐中的真實受檢狀態(tài)。另外，肝癌(7/9，77.80%)和回盲部惡性腫瘤(7/10，70.00%)的陽性檢出率結(jié)果表明Septin9基因甲基化檢測有望進一步成為其他消化道腫瘤的輔助診斷指標(biāo)。

在消化系統(tǒng)良性病變中，我們發(fā)現(xiàn)血漿Septin9基因甲基化的陽性率也增高(P=0.036)。ROC曲線分析表明，良性病變中其陽性率的增高降低了良性病變與惡性腫瘤的鑒別能力。結(jié)合其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合診斷(如在結(jié)直腸癌中結(jié)合CEA)能夠改善Septin9基因甲基化檢測的診斷效能。病理機制上，Septin9基因甲基化陽性率在良性病變中增高是否會促進病變從良性向惡性轉(zhuǎn)變有待進一步研究。同時，血漿Septin9基因甲基化陽性檢出率在Ⅲ～Ⅳ期的結(jié)直腸癌和胃癌患者及術(shù)前狀態(tài)患者中較高，證明了其甲基化程度與惡性腫瘤的進展和存在有著重要聯(lián)系，其甲基化程度可能是提示疾病進展、監(jiān)測手術(shù)效果和患者預(yù)后評價的潛在標(biāo)志物。

在目前的臨床實踐中，血漿Septin9基因甲基化檢測的使用具有一定的局限性。比如，檢測Septin9的費用較高，操作繁瑣；在無癥狀腫瘤患者中敏感性低[9]，限制了該檢測在腫瘤早期篩查中的應(yīng)用價值等。本研究的局限性主要為缺乏隊列研究，難以進一步評價Septin9甲基化狀態(tài)與預(yù)后和疾病進展之間的聯(lián)系。綜上，血漿Septin9基因甲基化檢測在結(jié)直腸癌和胃癌中具有診斷價值，在臨床實踐中結(jié)合其他診斷方法可提高其診斷效能。此外，Septin9基因甲基化與腫瘤進展存在相關(guān)的特性，表明其檢測在提示腫瘤進展、評價手術(shù)效果、評估患者預(yù)后上具有廣泛的應(yīng)用前景，但需要更多的醫(yī)學(xué)研究支持。