60Co-γ輻射苜蓿種子的變異植株葉片愈傷組織誘導及其誘變效應分析

李 波，劉 暢，李 紅，楊 曌

(1.齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是多年生豆科牧草，因其適應力強、產草量高、適口性好等特點，具有“牧草之王”的美譽，在很多國家被廣泛種植[1-2]。人為利用物理、化學等因素，誘發植物體產生遺傳性變異，在短時間內獲得有利用價值的突變體，并對突變體進行選擇鑒定，直接或間接培育成生產上有利用價值的突變體，是培育植物新品種的育種手段之一[3]。輻射育種是目前常用的新品種育種手段，常采用60Co-γ射線進行輻射，其后代變異率高、變異性狀穩定，能夠在較短時間內獲得突變體[4]。輻射誘變育種在國外應用得比較早，其后國內學者也相繼開展一些植物輻射誘變育種的研究，如馬鈴薯(Solanumtuberosum)愈傷組織在40 Gy的劑量下能夠獲得2%高鹽的愈傷組織突變體[5]；溝葉結縷草(Zoysiamatrella)愈傷組織經10 Gy的60Co-γ輻射處理對愈傷組織的再分化過程有明顯的促進作用，能夠在1%的NaCl再生培養基中獲得生長旺盛的再生植株[6]；60Co-γ射線輻射辣椒(Capsicumannuum)的愈傷組織，發現20 Gy的劑量下可獲得豐富的突變體[7]；對紅掌(Anthuriumandraeanum)愈傷組織進行60Co-γ輻射處理后，再生植株突變株的半致死劑量為30 Gy，且再生植株M1代和M2代的性狀一致，能夠穩定遺傳[8]。各種植物愈傷組織對輻射的敏感性不同，一般選擇低輻射劑量處理，可提高愈傷組織或其分化植株對鹽堿等逆境的抗性。

γ射線輻射在牧草研究中應用較多，國內的牧草誘變育種中，已針對紫花苜蓿[9]、扁蓿豆(Melissitusruthenica)[10]、黑麥草(Loliumperenne)[11]、草地早熟禾(Poapratensis)[12]、狼尾草(Pennisetumalopecuroides)[13]、高羊茅(Festucaelata)[14]的種子萌發、幼苗生長、生理生化特性、差異基因表達等方面的變化進行了研究和分析。苜蓿輻射育種的研究應用也比較廣泛，對輻射后苜蓿植株的Na+、K+、Ca2+和Mg2+含量、植株的生長發育、幼苗的顯微結構、生理生化變化和抗性篩選等研究較多，而輻射誘變的愈傷組織可增加創新育種的選擇性。本研究對60Co-γ射線輻射苜蓿種子的后代植株進行變異植株篩選，對標記的變異植株葉片進行愈傷組織誘導，分析其愈傷組織的誘導率和愈傷組織生理生化特征的變化，篩選出60Co-γ射線輻射的有利突變體，可為利用苜蓿愈傷組織進行抗逆性育種研究提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 60Co-γ射線輻射苜蓿種子和幼苗培養

‘龍牧806’苜蓿種子由黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院提供，種子的60Co-γ射線輻射處理在中國農業科學院原子能利用研究所進行，輻射劑量分別為600、800 Gy和900 Gy，劑量率為15 Gy·min-1。將當年輻射的苜蓿種子(M1)進行種植和收獲，獲得第二代輻射苜蓿種子(M2),以未經輻射處理的‘龍牧806’苜蓿種子為對照(CK)。

將輻射‘龍牧806’苜蓿種子M1和M2(600、800 Gy和900 Gy)和CK苜蓿種子用35℃溫水浸泡2 h，播種于育苗盆中(營養土∶珍珠巖=2∶1)，每盆播30粒種子，每個劑量10盆，置于室溫下培養75 d后待用。

1.2 60Co-γ射線輻射龍牧806種子變異植株篩選

對60Co-γ射線輻射龍牧806的 M1和M2苜蓿種子進行幼苗培養，將培養75 d后的苜蓿植株進行株高、葉面積測量，株高(cm)用直尺測量，葉面積采用描形稱重法進行測量。以未輻射的植株為對照(CK)，篩選的矮化植株用A表示，高植株用G(G1,G2,G3和G4)表示，畸變株用J表示。葉面積測定所用硫酸紙為100 cm2(質量0.2831 g),計算葉面積系數(a)，a(紙重面積系數)=(10×10)/0.2831=353.2321，并以每株10個葉片進行葉面積測定，取平均值。

式中，W1為所畫紙葉的質量，W2為標準 10 cm2的紙片質量[15]。

1.3 變異植株葉片愈傷組織的誘導

對照苜蓿植株葉片在MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.75 mg·L-1的愈傷組織誘導培養基中進行培養，愈傷組織誘導率為100%，可誘導產生質地疏松的黃綠色愈傷組織。以此愈傷組織誘導培養基對輻射變異植株的葉片進行愈傷組織誘導，培養20 d后統計愈傷組織誘導率和褐化率。

愈傷組織誘導率(褐化率)(%)=誘導(褐化)愈傷組織塊數(塊)/接種外植體塊數(塊)×100%

1.4 愈傷組織生理指標的測定

參考鄒琦[16]的方法對培養15～18 d的愈傷組織進行9項指標測定。可溶性蛋白(Soluble protein，SP)含量采用考馬斯亮藍法，可溶性糖(Soluble sugar，SS)含量采用蒽酮比色法，脯氨酸(Proline，Pro)含量采用酸性茚三酮法，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法，相對電導率(Relative conductivity，RC)測定采用電導法，過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性采用愈創木酚法，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性采用氮藍四唑光化還原法，過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性采用紫外吸收法。各指標測定值均重復3次。

1.5 數據處理與分析

采用Excel 2010對數據進行統計處理，利用SPSS 21.0對測定生理生化指標進行單因素方差分析(ANOVA)。

隸屬函數值計算公式為：

R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

反隸屬函數值計算公式為：

R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，Xi為指標的測定值，Xmax、Xmin為所有試驗材料某項指標的最大值和最小值，隸屬值進行累加后求出平均隸屬值，公式為：

X=∑U(Xi)/n

式中，X為平均隸屬函數值，隸屬函數值越大表明其向有利方向突變的可能性越大。

2 結果與分析

2.1 60Co-γ射線輻射龍牧806紫花苜蓿種子的變異植株篩選

輻射后植株的性狀變異早期主要表現在葉型、葉色和株高等，經過不同劑量輻射后幼苗株高和葉面積變化不同(表1和圖 1)，A株的株高比CK株矮了29.4 cm，G(G1，G2，G3，G4)株為偏高株，株高分別比 CK 增高了 39.6、29.8、26.6 cm和45.3 cm，J株的株高比CK株矮了17.9 cm。由于A株既矮葉片又小，導致其葉面積無法測量；G2和G3株的葉面積分別比CK增加了12.15%和 28.18%，G1、G4和J株葉面積均比CK株降低了22.10%、24.86%和27.07%；輻射變異植株的株高和葉面積與CK比較均差異顯著(p<0.05)。在對3種輻射劑量的‘龍牧806’苜蓿M1和M2代種子的幼苗培養中，除G2株為M1代輻射(600 Gy)種子篩選的變異株外，A、G1、G3、G4和J株均為M2代種子篩選獲得的變異株，說明不同輻射劑量對苜蓿植株的性狀變異產生不同的影響，且在M2代可獲得較多的變異類型。

表1 60Co-γ輻射苜蓿變異植株的生長特征

2.2 變異植株葉片愈傷組織的誘導和繼代培養

60Co-γ輻射變異植株葉片愈傷組織褐化率和誘導率見表 2。所有供試植株愈傷組織誘導率變化范圍為90%～100%，其中J植株誘導率最低，為79.35%。在誘變的后代植株中， A株愈傷組織褐化率為5.41%，略高于CK株愈傷組織，其余輻射植株愈傷組織的褐化率均低于CK株，介于0.00%～2.00%。除J株愈傷組織誘導率外，其余輻射植株葉片誘導的愈傷組織誘導率差異不明顯，說明所選擇的3種輻射劑量均可使苜蓿葉片被誘導產生愈傷組織，利用輻射誘變與離體培養結合能增加誘變群體的選擇性，提高后代的被篩選性。

表2 苜蓿變異植株葉片愈傷組織的誘導率和褐化率

CK和各輻射株葉片愈傷組織初代培養與繼代培養的生長情況見圖1和圖2(誘導培養基相同)。愈傷組織初代培養20 d后(圖1)，不同輻射組的愈傷組織顏色與CK愈傷組織均有差異，CK愈傷組織顏色淺黃綠色，A、G1、G2、G3、G4株愈傷組織分別呈綠色、綠色、淺黃色、淺綠色、黃色，G4株的愈傷組織出現部分褐化現象，J株愈傷組織呈淺黃色，且增值速度極慢。愈傷組織繼代2次后(圖2)，變異植株愈傷組織顏色與誘導初期產生一定差異，CK株愈傷組織呈黃綠色，A、G1、G2、G3、G4株愈傷組織分別呈綠色、淺黃綠色、黃綠色、綠色、綠色，G2株愈傷組織褐化嚴重，G4株部分愈傷組織褐化，J株愈傷組織呈褐色，且生長速度緩慢。

2.3 變異植株葉片愈傷組織滲透調節物質的變化

變異植株葉片愈傷組織的3種滲透調節物質含量變化見圖3，不同輻射劑量變異植株葉片愈傷組織的SP、SS和Pro含量變化趨勢不同。變異植株葉片中的 J株愈傷組織SP含量最高，為 6.92 mg·g-1；G2株愈傷組織SP含量最低，為1.98 mg·g-1，A、G1、G2、G3、G4和J愈傷組織SP含量分別比CK組增加了245.18%、72.03%、29.08%、247.08%、187.82%和351.18%，除G2株愈傷組織SP含量外，其他后代植株愈傷組織的SP含量與CK組比較均差異顯著(p<0.05)。在各組愈傷組織中，J株愈傷組織SS含量最高為1.48%，G4株愈傷組織SS含量最低為0.12%，G2、G3、J株愈傷組織SS含量分別比對照組增加了9.61%、7.69%和390.47%，除A、G2和G3株愈傷組織外，其余株系愈傷組織SS含量與CK比較均差異顯著(p<0.05)。變異植株葉片愈傷組織中，G3株愈傷組織Pro含量最高，為58.72 μg·g-1；G2株愈傷組織Pro含量最低，為16.72 μg·g-1；A、G1、G2、G3、G4和J株愈傷組織Pro含量均低于CK組，且愈傷組織Pro含量與CK組比較均差異顯著(p<0.05)。

2.4 變異植株葉片愈傷組織膜透性的變化

變異植株葉片愈傷組織的2種膜透性相關指標變化見圖4，不同處理變異植株葉片的愈傷組織MDA含量和RC變化趨勢不同。在各處理愈傷組織中，G4株愈傷組織MDA含量最高，為0.57 μmol·L-1；G3株愈傷組織MDA含量最低，為0.44 μmol·L-1；G3和J株愈傷組織MDA含量分別比CK組降低了14.37%和9.21%；G3、G4和J株愈傷組織MDA 含量與CK組比較均差異顯著(p<0.05)。變異植株葉片的愈傷組織中，J株愈傷組織RC最高,為109.62%;G3株愈傷組織RC最低,為44.44%;A、G1、G2、G3和G4組愈傷組織RC分別比CK組降低了7.45%，7.07%、24.65%、46.25%和2.81%;除A、G1和G4外，其余變異植株葉片愈傷組織的RC與CK組比較均差異顯著(p<0.05)。從輻射對苜蓿愈傷組織的MDA含量和RC變化可知，G3愈傷組織可耐受一定的輻射劑量。

2.5 變異植株葉片愈傷組織抗氧化酶活性的變化

變異植株葉片愈傷組織的3種抗氧化酶活性變化見圖5，不同輻射劑量變異植株葉片的愈傷組織POD、SOD和CAT活性變化趨勢不同。在各處理愈傷組織中，G2株愈傷組織POD活性最高，為98.40 μmol·min-1·g-1；J株愈傷組織POD活性最低，為7.15 μmol·min-1·g-1；A、G1、G2和G3株愈傷組織的POD活性分別比CK組增加了44.65%、42.45%、57.92%和26.39%;除G3株愈傷組織的POD活性外，其他株系愈傷組織的POD 活性與CK比較均差異顯著(p<0.05)。變異植株葉片中的 G3株愈傷組織SOD活性最高,為123.45 μmol·min-1·g-1;G4株愈傷組織SOD活性最低,為103.05 μmol·min-1·g-1;A、G1、G2、G3、G4和J株愈傷組織SOD活性均低于CK組，變異植株葉片的愈傷組織的SOD活性與CK組比較均差異顯著(p<0.05)。A株愈傷組織CAT活性最高,為911.67 μmol·min-1·g-1; G2株愈傷組織CAT活性最低,為526.67 μmol·min-1·g-1；A株愈傷組織CAT活性比CK組增加了4.19%，G2和J株愈傷組織的 CAT 活性與CK組比較差異顯著(p<0.05)。從3種抗氧化酶活性的變化可知，不同輻射劑量對苜蓿愈傷組織的抗氧化酶系統有不同的效應。

2.6 變異植株葉片愈傷組織各測定指標的主成分分析

變異植株誘導的愈傷組織生理生化相關指標的主成分分析特征值和貢獻率見表3，各指標主成分分析矩陣見表4，在所測定的8項生理生化指標的特征值和貢獻率中，前4個主成分累積貢獻率為94.683%，特征值總和為7.574。對變異植株誘導愈傷組織的8項指標進行計算，各生理生化指標綜合性狀貢獻大小的特征向量見表5。

表3 苜蓿愈傷組織生理生化相關指標主成分分析的特征值和方差貢獻率

根據主成分分析的特征值和相關矩陣值算出特征向量值(表5)，主成分Y1中SS的荷載值最大，其次是RC和SP，主成分Y2中Pro荷載值最大，其次是CAT和SOD，主成分Y3中CAT的荷載值最大，其次是MDA，主成分Y4中RC的荷載值最大，其次是SOD。依據特征向量大于0.300的標準，第一主成分主要是反映了SS這個生理指標的變化，第二主成分主要反映了Pro這個生理指標的變化，第三主成分主要反映了CAT和MAD這2個生理生化指標的變化，第四主成分主要反映了RC、MDA和SOD這3個生理生化指標的變化。綜合分析60Co-γ輻射影響苜蓿愈傷組織生理生化特性的主要指標為SS、Pro、CAT、MDA，RC和SOD。

表5 苜蓿愈傷組織各指標相關矩陣的特征向量

2.7 變異植株葉片愈傷組織各指標的綜合評價

60Co-γ輻射苜蓿種子后，變異植株葉片所誘導愈傷組織的生理生化特性表現不一致，單個指標不能全面地反映60Co-γ輻射對幼苗葉片愈傷組織的影響，根據主成分分析可知60Co-γ射線輻射主要影響苜蓿愈傷組織的SS、Pro、CAT、MAD、RC和SOD。采用隸屬函數法進行綜合分析，6項指標的隸屬函數值見表6。愈傷組織平均隸屬函數值排序為G3>CK>J>A>G1>G2>G4，G4株愈傷組織的隸屬函數值最小，G3株愈傷組織的隸屬函數值最大，且高于CK，說明G3株愈傷組織為60Co-γ輻射的有利突變體。

表6 苜蓿愈傷組織6項生理生化指標隸屬值

3 討 論

3.1 60Co-γ輻射種子處理對苜蓿植株形態變異的影響

利用輻射誘變育種選擇突變株，常以植株形態學上的變化差異作為依據。60Co-γ輻射可以改變植株的葉片形態和生長性狀，但不同輻射劑量對植株葉片形態和生長的影響也不同，一般低劑量輻射對植株的株高、出苗率、鮮質量、干質量有促進作用，但低劑量的輻射誘變率比較低，因此合適輻射劑量有助于突變的發生[17]。不同品種苜蓿對60Co-γ射線輻射敏感度不同，劉淑霞等[18]研究60Co-γ輻射對4個紫花苜蓿品種(WL319、斯貝德、巨能耐鹽、龍牧806)生長及生理特性的影響發現，在相同輻射劑量下，‘巨能耐鹽’品種對低劑量輻射更敏感，‘龍牧806’苜蓿在800 Gy劑量下株高與對照植株間無明顯差異；張偉麗等[19]研究表明60Co-γ(325、487、974Gy)輻射能夠抑制M1代柱花草(Stylosanthesguianensias)的生長，熊志波等[20]研究表明60Co-γ輻射使M2代高羊茅的株高降低。但本研究中利用60Co-γ輻射‘龍牧806’M1代(800 Gy和900 Gy)苜蓿種子未能篩選到變異植株，而在M1代(600 Gy)和M2代(600、800 Gy和900 Gy)均有變異植株，且表現出在株高、葉形等方面的不同變異性狀，M2與M1代比較其所標記的變異植株更多，推測輻射效應在M2代更穩定。

3.2 60Co-γ輻射種子處理對苜蓿愈傷組織誘導的影響

輻射誘變處理在牧草中的應用越來越廣泛，植物組織培養與輻射誘變相結合可在較短的時間內獲得大量突變體，加速創造牧草新的種質資源。不同植物材料的不同部位對輻射敏感度不同，處于生長最旺盛階段的分生組織最為敏感[21]，而利用愈傷組織直接進行輻射處理會抑制愈傷組織的生長和再分化，如孟祥茹[22]研究發現隨著輻射劑量的增加，延長人參愈傷組織恢復培養的時間，導致水分嚴重丟失，減緩增值速率；邢莉莉[23]在研究60Co-γ對切花菊試管苗的誘變效應時發現，γ射線對試管苗莖段和葉片愈傷組織的誘導和分化有明顯的抑制作用，且隨著輻射劑量的增加抑制作用更強。

干燥種子是牧草輻射誘變育種的理想材料，具有代謝水平低、操作簡單、能耐較高輻射劑量等特點[24]，在本研究中利用60Co-γ射線直接處理苜蓿干種子，變異植株葉片誘導的愈傷組織與對照之間的愈傷組織顏色、生長狀態有一定差異，其誘導率和褐化率與對照間差異不大。李振芳[25]對除蟲菊種子輻射效應及其組織培養的研究發現，葉柄愈傷組織的誘導好于葉片，葉片直接誘導芽的效果不理想，出芽時間長、出芽率極低、褐化較嚴重，與本研究結果有一定的印證作用，但也有不同之處，可能與材料的不同有關。

3.3 60Co-γ輻射種子處理對苜蓿愈傷組織生理生化特性的影響

植物體內滲透調節物質含量的增加可以降低輻射引起的傷害[26]。本研究表明，輻射誘變種子發育成突變植株的葉片愈傷組織中，3種滲透調節物質含量發生了不同的變化，輻射可促進苜蓿愈傷組織SP的積累，但Pro含量均明顯低于CK，SS含量變化既有高于CK，又有低于CK，因此輻射影響了苜蓿愈傷組織對3種滲透調節物質的代謝及累積。60Co-γ輻射導致物質的離子化，對細胞的損傷引起氧化脅迫，伴隨活性氧類物質(ROS)過量產生，造成細胞的氧化損傷，一些抗氧化酶類可以清除活性氧[27]，其中MDA是ROS啟動膜脂過氧化的產物之一，可衡量植物受到逆境傷害的程度大小；RC是細胞結構穩定性的指標，RC值越大植物細胞膜受損越嚴重[28]。本研究中G3和J植株愈傷組織 MDA含量較CK降低，A、G1、G2、G3和G4植株愈傷組織RC較CK降低，表明輻射誘導的愈傷組織在面對損傷引起脅迫時啟動了自身的防御機制，抵抗對植物細胞膜造成的損傷。POD、SOD和CAT的生成被激活，通過有效抑制植物體內活性氧的積累來緩解輻射造成的損傷[29]。本研究中植株A、G1、G2和G3葉片愈傷組織的POD活性較CK顯著增加，而愈傷組織SOD和CAT活性與CK比較則無顯著差異。

本研究通過60Co-γ射線誘變獲得了在育種實踐中具有特殊應用價值的材料，如高株型和矮株型苜蓿突變株愈傷組織等，被誘導愈傷組織內滲透調節物質含量及相關酶活性增加，可作為篩選具有抗逆性的突變體材料。關于輻射苜蓿愈傷組織高頻率分化體系建立以及突變體耐逆性目前尚在繼續研究中。

4 結 論

對60Co-γ輻射‘龍牧806’紫花苜蓿的M1和M2代種子進行變異植株篩選，篩選出矮化、偏高和畸變不同變異類型植株，將對照和變異植株的葉片進行愈傷組織誘導，除 J株葉片愈傷組織誘導率為79.35%外，CK和其他5類變異植株的葉片愈傷組織誘導率均達90%以上。輻射對苜蓿愈傷組織生理生化代謝產生不同的影響，主成分分析顯示愈傷組織逆境生理生化指標受輻射影響的主要有SS、Pro、CAT、MAD、RC和SOD。將該6項生理生化指標隸屬函數進行分析，其隸屬值排序依次為G3>CK>J>A>G1>G2>G4，G3愈傷組織可用于紫花苜蓿抗逆性突變體的篩選。