蘭州百合不同連作年限土壤中化感物質的檢測及其自毒效應的研究

黃鈺芳，張恩和，張新慧，曹 瑞，謝田朋，陳紅剛，高素芳

(1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州 730070；3.寧夏醫科大學藥學院，寧夏 銀川 750004)

蘭州百合(Liliumdavidiivar.unicolor)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)川百合的變種，具有400多年的栽培歷史。因鱗莖潔白、肉質甜美，享有“蔬菜人參”的美譽[1]。蘭州百合產業是蘭州市南郊二陰山區經濟發展、農民創收的主要產業。但是近年來，連作重茬現象嚴重，已造成蘭州百合產量和品質的大幅下降，連作障礙問題日漸凸顯，已嚴重影響到蘭州百合產業的持續性發展[2-4]。

連作障礙的發生是作物-土壤系統內多種因素相互關聯、綜合作用的結果。土壤養分失衡、土壤鹽漬化和酸化、土壤酶活性的變化均能導致連作障礙[5]。除此之外，植物根系分泌物及殘體分解物所引起的自毒作用也是導致連作障礙發生的重要原因。自毒效應在許多作物中已經得到證實[6-9]。研究顯示[1,10]，自毒作用也是引起蘭州百合連作障礙的重要因素之一。鑒于此，本試驗動態研究了蘭州百合生長旺盛期和收獲期各連作年限下根際土壤中的化感物質，并利用生物活性試驗對其中典型的化感物質進行了自毒效應的驗證，以期進一步明確蘭州百合連作障礙發生的可能性機制，并為緩解和克服連作障礙奠定科學基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于甘肅省蘭州市七里河區蛟龍寺村，海拔1 700 m。該地區屬蘭州市南郊二陰山區，大陸性半干旱氣候，年平均氣溫5.8℃，生長期平均232 d，≥10℃的年積溫為2 200℃，無霜期平均135 d，年均降水量460 mm，適合蘭州百合喜溫涼、喜光照、好濕潤的生理特征。

1.2 試驗設計和種植管理

2017年3月于海拔相同、坡度相近的陽坡選擇歇地3 a(前茬作物為蘭州百合)、連作2 a及連作4 a的蘭州百合地塊，每一地塊劃分3個小區作為相同處理的3個重復，每一小區面積為20 m2。以蛟龍寺蘭州百合種植基地提供的蘭州百合種球為受試對象，進行大田小區試驗。

正茬、連作2 a和連作4 a地塊土壤均為沙壤土。3種土壤中速效氮分別為：571.0、613.8 mg·kg-1和140.8 mg·kg-1，速效磷分別為：229.6，23.7 mg·kg-1和30.4 mg·kg-1，速效鉀分別為：378.1、324.4 mg·kg-1和348.5 mg·kg-1，以最高值為基準，將3種土壤肥力補充至相同水平。選擇包合緊密、基盤健康、大小均一的蘭州百合種球進行種植，全生育期不再追肥，正常管理。

2017年8月和10月，即在蘭州百合生長旺盛期和收獲期，分別于不同處理地塊隨機挖取健康植株，抖掉根系大塊土壤后，收集黏貼在根系4 mm以內的土壤，過篩后將每一處理土壤混合均勻，分別留存備用。

1.3 不同連作年限土壤浸提液的制備及GC-MS分析

稱取生長旺盛期及收獲期不同連作年限根際土壤各500 g，用8倍量蒸餾水振蕩浸漬24 h后抽濾，濾液離心10 min，取上清液濃縮至適量，用氯仿分別萃取后，收集氯仿液，減壓濃縮至0.5 mL，用于GC-MS測定。

GC-MS條件：采用黃鈺芳等[11]的GC-MS條件對不同連作年限根際土壤浸提液進樣分析，應用計算機檢索系統將質譜數據與數據庫進行匹配，得到未知物的結構類型。

利用相似系數公式，比較不同連作年限土壤中化合物的相似度。

式中，a、b、c分別為正茬、連作2 a及4 a土壤中獨有的成分數目，d為共有成分數目(a、b、c代表的成分其相對含量均大于1%，d代表共有成分中至少有一個的相對含量大于1%)。

1.4 自毒物質的生物活性檢測

為進一步檢測被鑒定化學物質的自毒效應，利用對苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246的外源化合物(分別用D和A表示)，測定兩物質在單施及共施條件下對蘭州百合幼苗的化感自毒效應。對苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246均購置于上海達瑞精細化學品有限責任公司。

1.4.1 單施時對苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246的自毒效應研究 結合前期試驗結果，用氯仿將上述2種外源化合物溶解后各配制成濃度為0.2 mg·mL-1和5.0 mg·mL-1的溶液，分別標記為D0.2和D5、A0.2和A5。生物學試驗采用培養皿法。于培養皿底部墊入2層濾紙，分別精密吸取不同處理溶液10 mL，待溶劑揮干后，選取基盤健康、大小均勻的蘭州百合種球，放入培養皿，每皿9粒種球。以溶劑氯仿為對照，每處理重復3次。將種植后的培養皿放入培養箱，25℃條件下培養15 d。之后，對蘭州百合幼苗的各項生長指標進行測定。

1.4.2 共施時對苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246的互作效應研究 在單施試驗的基礎上，進行互作效應試驗，分別用D0.2A0.2、D0.2A5、D5A0.2及D5A5表示，研究2種物質混合液對蘭州百合幼苗生長的影響。試驗方法同1.4.1節，在精密量取不同濃度的對苯二甲酸二辛酯溶液10 mL后，按照試驗設計再分別加入相應濃度的抗氧劑2246溶液10 mL，待氯仿完全揮干后，種植蘭州百合種球，培養15 d后，測定各項指標。

化感效應指數(Response index ，RI)采用Williamson的方法計算[12]：

式中，C為對照值，T為處理值。

綜合化感效應(Synthesis effect，SE)為各項指標RI的平均值。RI>0、SE>0表示促進；RI<0、SE<0表示抑制；絕對值的大小表示化感作用強度。

1.5 數據分析

利用SPSS 21.0進行單因子方差分析，采用新復極差法(Duncan)進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 生長旺盛期蘭州百合不同連作年限土壤中化感物質的檢測

由表1可知，生長旺盛期從蘭州百合正茬、連作2 a及連作4 a根際土壤中分別鑒定出11、15和19種化合物，主要包括：醇類、醛類、酯類、胺類、酚酸類及部分萜類物質，其中大部分曾被報道為自毒物質[13-15]，GC-MS色譜圖見圖1。對表1中各處理相對含量大于1%的組分進行相似系數計算，發現生長旺盛期各處理土壤中所含化合物的相似系數為15.38%。其中，抗氧劑2246 和對苯二甲酸二辛酯在各處理中均被檢出，且二者相對含量較高。正茬、連作2 a及連作4 a土壤中，抗氧劑2246的相對含量分別為16.69%、17.82%和18.96%，對苯二甲酸二辛酯相對含量分別達到26.97%、31.29%和63.21%。綜上可見，生長旺盛期蘭州百合正茬、連作2 a及連作4 a土壤中自毒物質的種類差異較大，且連作年限越長，自毒物質種類及數量的差異性越大。

表1 生長旺盛期不同連作年限蘭州百合土壤中的化感物質

2.2 收獲期蘭州百合不同連作年限土壤中化感物質的檢測

表2顯示，收獲期蘭州百合正茬、連作2 a及連作4 a根際土壤中分別存在9種、15種及17種化合物，所含化合物類別與生長旺盛期的檢測結果相類似，包含了醇類、醛類、酯類和少數酚酸及萜類物質，GC-MS色譜圖見圖2。除正茬土壤中未檢測到抗氧劑2246外，其他處理中仍存在對苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246，且相對含量仍較高。與生長旺盛期相比，收獲期各處理中被鑒定化合物的相似系數為12.50%，較前者下降了18.73%。綜合可見，隨連作年限的延長，收獲期蘭州百合土壤中存在的自毒物質種類同樣有所增加，且各處理土壤中存在的自毒物質差異性較旺盛期增大。

表2 收獲期不同連作年限蘭州百合土壤中的化感物質

2.3 對苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246的自毒效應研究

2.3.1 單施時對苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246的自毒效應 由表3可知，2種濃度條件下，對苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246對蘭州百合幼苗苗長和根長均表現出抑制作用，且5.0 mg·mL-1時抑制作用增強；對于苗鮮重和根鮮重，前者表現出“低促高抑”現象，而后者均表現出促進作用，但隨濃度的升高促進作用減小。綜合分析可知，在0.2 mg·mL-1和5.0 mg·mL-1條件下，同一化感物質對蘭州百合幼苗的各項生長指標具有不同的化感效應；而相同濃度時，不同的化感物質對蘭州百合幼苗的化感效應也存在差別。

就綜合化感效應指數而言，對苯二甲酸二辛酯在0.2 mg·mL-1條件下就能抑制蘭州百合幼苗的生長，而抗氧劑2246在濃度為5.0 mg·mL-1時才發揮抑制效應。

表3 對苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246對蘭州百合幼苗的化感效應

2.3.2 共施時對苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246的互作效應 為進一步深入考察化感物質間的相互作用，在固定對苯二甲酸二辛酯濃度后，配合不同濃度的抗氧劑2246，進行化感物質間的互作效應試驗(表4)。

表4 對苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246混合液對蘭州百合幼苗的化感效應

對表4和表3的SE分析后可以看出，D0.2和D5的SE為負值，表明D0.2和D5對蘭州百合幼苗表現出抑制作用，當加入相同作用的A5后，D0.2A5和D5A5的SE仍為負值，但其絕對值并未增加，說明D0.2A5和D5A5未表現出抑制協同作用；當給D0.2和D5中加入促進作用的A0.2后，D0.2A0.2的SE為正值，但絕對值較A0.2減小，D5A0.2的SE為負值，其絕對值較D5減小，說明兩成分間表現出一定的疊加效應。

綜合以上結果可以看出，對苯二甲酸二辛酯(D)和抗氧劑2246(A)間存在一定的相互作用，具體表現出：若兩成分單施作用方向相同，共施時沒有表現出同方向的協同效應；若兩成分單施作用方向相反，共施時表現出反方向的疊加效應。

3 討論與結論

3.1 蘭州百合各生育期不同連作年限土壤中自毒成分的比較

本試驗結果顯示，生長旺盛期蘭州百合正茬、連作2 a及連作4 a根際土壤中分別存在11、15和19種化合物，收獲期各處理土壤中分別存在9、15及17種成分。主要包括：醇類、醛類、酯類、胺類、酚酸類及少量萜類化合物，其中大部分曾被報道為化感自毒物質[13-15]。同一生育期不同連作年限相比，連作4 a土壤中分離得到的成分最多，連作2 a土壤次之，正茬土壤中存在的化合物最少。可見，隨著連作年限的延長，蘭州百合植株向土壤中分泌的次生代謝產物不斷累積，從而造成連作時間越長，自毒物質的種類和數量越多。就不同生育期而言，生長旺盛期蘭州百合土壤中存在的化合物較多，收獲期較少。生長旺盛期植物體內代謝頻繁，形成的次生代謝產物較多，從而向土壤中分泌的化合物種類和數量也有所增加；收獲期植物體內代謝減弱，加之各種微生物對土壤中化合物的不斷分解，造成土壤中自毒物質種類較旺盛期有所減少且差異性有所增加。

研究顯示，孫鴻強[16]從蘭州百合連作土壤中檢測出香豆酸、烏頭酸、苯甲酸和鄰苯二甲酸等多種酚酸類成分，而在本試驗中鑒定出的物質主要有：醇類、醛類、酯類和少量酚酸類及萜類化合物，尚未檢測到諸多酚酸類物質。這可能是研究者采用的檢測方法、利用的供試對象以及收集供試材料的時間和地點不同等多種因素造成的。

3.2 對苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246作為典型自毒物質的原因闡釋

本試驗中，除收獲期正茬土壤外，在其余處理土壤中均鑒定出對苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246，且其相對含量均較高。對苯二甲酸二辛酯與前人[17-23]檢測到的苯甲酸酯類化感物質在結構和性質上存在更多的相似性，而抗氧劑2246在陳君良等[23]的研究中已證實具有化感效應。故在本試驗中將二者作為蘭州百合連作土壤中存在的典型自毒物質，對其單施和共存時的化感效應進行了研究。

此外，前期結合生物活性試驗測定了旺盛期對苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246在連作4 a土壤浸提液中的濃度貢獻大小分別為1.97 mg·mL-1和0.21 mg·mL-1；收獲期二者的濃度貢獻分別為1.90 mg·mL-1和0.02 mg·mL-1。自毒作用的大小與溶液濃度的高低有著密切的關系，故在預試驗中結合文獻報道[24]設置了0.02、0.2、2.0 mg·mL-1及5.0 mg·mL-1的濃度溶液，研究了4種濃度條件下對苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246對蘭州百合幼苗生長的影響，結果發現0.2 mg·mL-1和5.0 mg·mL-1的濃度溶液對蘭州百合幼苗生長的影響最顯著。因此，在本試驗中選擇了0.2 mg·mL-1和5.0 mg·mL-1的濃度條件對2種成分的自毒作用進行了研究。

3.3 對苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246自毒效應的比較

研究顯示[25]，自毒物質在發揮自毒作用時具有一定的濃度效應，即自毒效應會隨著自毒物質濃度的不同而呈現出不同的作用方向和作用大小。本試驗結果顯示，0.2 mg·mL-1和5.0 mg·mL-1條件下，對苯二甲酸二辛酯對蘭州百合幼苗的生長均產生抑制作用，但5.0 mg·mL-1時抑制作用更強。與之相比，抗氧劑2246在0.2 mg·mL-1時對蘭州百合幼苗表現出促進作用，而在5.0 mg·mL-1時表現出生長抑制效應。可見，不同的自毒物質具有不同的自毒效應，而同一物質在不同的濃度條件下也呈現出不同的作用方向和大小。這一結果與前人的研究結論相似[26]。

植物土壤中存在多種自毒物質，它們對同種植物表現出的自毒作用是多種成分共同體現出來的，是這些物質的復合效應[27]。因此，許多學者總是在自毒物質單獨作用效應的基礎上研究自毒物質間的復合效應。如母容等[28]在研究阿魏酸、對羥基苯甲酸及其混合液對土壤氮素的影響時發現，混合液對土壤氮素轉化的抑制作用最強，表明阿魏酸和對羥基苯甲酸存在協同作用。姜男[29]研究發現，0.4 μmol·L-1的咖啡酸對灰菜根長表現出顯著的抑制作用，但當加入抑制貢獻率為0的水楊酸后，其混合液對灰菜根長的抑制率下降了97.8%，表現出水楊酸對咖啡酸的拮抗效應。本試驗在研究對苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246的互作效應時發現，如果二者單施作用方向相同，即均能抑制蘭州百合幼苗生長，共施時沒有表現出抑制協同效應；而若單施作用方向相反，共施條件下表現出了反方向的疊加作用。綜合以上分析可以看出，不同的自毒物質對同種植物產生的作用效果有所差異，且自毒物質間的相互作用程度和作用方向也存在差別，體現出化感自毒物質間復雜多樣的作用特點。