外源硫化氫對NaCl脅迫下棉花幼苗抗逆生理特性的影響

陳明媛，張淑英，王夢柯，吳 鶯

(石河子大學農學院，新疆 石河子 832003)

土壤鹽漬化作為世界性的資源和生態問題之一[1]，對農業生產造成很大的負面影響。新疆地理位置特殊，位于我國西北干旱區，由于水資源匱乏、蒸發量大及灌溉方式不合理，使新疆土壤的次生鹽漬化面積大范圍擴大[2]。在鹽漬條件下, 植物為維持其基本生命特征會激活體內多種生理生化機制[3],如棉花葉片葉綠體降解、葉綠素流失及光合速率下降，從而降低棉花葉片對光能的捕獲和利用，誘導衰老相關轉錄因子基因的表達，引起葉片早衰[4]。新疆已成為我國最大的棉花生產基地，棉花產業在新疆農業產業化中占據著主導地位[5]，研究棉花耐鹽機制及抗鹽保護措施，對提高新疆現有棉花的生產能力具有現實意義。

硫化氫(H2S) 作為一種重要的內源氣體信號分子，在促進葉綠體的生物合成和增強光系統酶的表達功能上均表現出重要作用[6]。現已證實外源H2S處理顯著提高了番茄幼苗抗氧化水平，不僅能緩解鹽脅迫對加工番茄幼苗造成的氧化損傷，還能提高加工番茄幼苗對鹽脅迫的適應和抵抗能力[7]。H2S亦可以增強草木樨對抗鹽脅迫的能力，減小細胞膜的透性[8]。王燕琴[9]研究表明，H2S能促進苜蓿種子的萌發，緩解由鹽脅迫引起的氧化傷害。然而，H2S對鹽脅迫下棉花幼苗生長及光合特性的影響卻少有報道。本試驗采用盆栽法，在鹽脅迫下通過外源噴施NaHS (H2S供體) 處理棉花幼苗，研究外源H2S對鹽脅迫下棉花幼苗光合特性及抗氧化酶活性的影響，探討H2S對鹽脅迫下棉花生長發育的生理響應機制，以期為新疆棉花生產中的抗鹽問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗于2019年4月在石河子大學試驗站進行。供試棉花品種為新陸早48號，外源硫化氫(H2S)供體為NaHS。

1.2 試驗設計

試驗設鹽分(NaCl分析純，0、100、200 mmol·L-1)和硫化氫供體(NaHS分析純，0、20、50、100、500 μmol·L-1)兩因素交互，共11個處理(如表1所示)，每處理重復3次。試驗采用室外盆栽栽培，挑選大小均勻的棉花種子于(25±1)℃光照培養箱內進行催芽處理，將發芽種子播種于蛭石為基質的營養缽中，營養缽放置于周轉箱內。待棉花幼苗長至兩葉一心時配制Hoagland營養液進行澆灌，一周后進行鹽分處理。鹽脅迫一周后進行外源H2S處理。其中，鹽分處理是將NaCl直接溶于營養液中進行澆灌，H2S處理則將NaHS溶于蒸餾水中按不同濃度處理進行葉面噴施。出苗60 d后取倒三、倒四葉測定各項指標。

表1 試驗處理及對應編號

1.3 測定項目

將棉花幼苗根、莖、葉分離并測定鮮質量后裝入牛皮紙袋中，在烘箱中105℃殺青30 min后，烘干至恒重，分器官稱量干質量，由“根系干質量/莖葉干質量”計算得出根冠比；葉綠素(Chl)含量的測定參考乙醇-丙酮混合法[10]；利用調制熒光儀 (Imaging-PAM，WALZ,德國)，將幼苗功能葉遮光處理30 min后，測定葉綠素熒光參數光化學猝滅系數(qP)、非光化學猝滅系數(qN) 、PSⅡ調節性能量耗散[Y(NPQ)]、PSⅡ非調節性能量耗散[Y(NO)]；利用光合儀(Li-6400，LI-COR,美國)測定凈光合速率(Pn)，蒸騰速率(Tr)，氣孔導度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)等光合氣體參數；過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚氧化法[11]，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑(NBT)法[12]，過氧化氫酶(CAT)活性采用分光光度計法[13]。

1.4 數據統計分析

采用Microsoft Excel 2010進行數據處理，用SPSS 19.0進行統計分析，并運用Duncan法進行差異顯著性檢驗(p<0.05)，用Sigmaplot 14.0作圖。

2 結果與分析

2.1 外源H2S對鹽脅迫下棉花幼苗生長的影響

由表2可以看出，200 mmol·L-1NaCl脅迫比100 mmol·L-1NaCl脅迫對棉花幼苗地上部鮮質量、地上部干質量及地下部干質量產生了更大程度的抑制作用。未添加H2S處理的棉苗生物量隨NaCl濃度的升高而減少，其中T1與CK相比，棉花地上部鮮質量、地上部干質量和地下部干質量分別下降了37.24%、45.31%、29.63%；K1與CK相比，地上部鮮質量、地上部干質量和地下部干質量分別下降了47.59%、50.78%、37.04%。相同NaCl不同H2S濃度處理下棉花幼苗生物量均有不同程度的增長，如T2、T3、T4、T5與T1相比，棉苗地上部鮮質量分別增加了35.34%、28.79%、9.31%、19.66%，H2S濃度為100 μmol·L-1(T4、K4處理)時地上部鮮質量、地上部干質量最大。說明外源H2S能提高棉花幼苗對鹽脅迫的抵抗能力，緩解棉花幼苗生長過程中NaCl脅迫帶來的抑制作用，且以H2S濃度為100 μmol·L-1時效果最佳。

方差分析表明，棉花幼苗地上部鮮質量、地上部干質量和地下部干質量隨NaCl濃度升高而顯著下降(p<0.01)。NaCl與H2S交互作用，各處理棉花幼苗地上部鮮質量、地上部干質量、地下部干質量和根冠比均與CK間差異顯著(p<0.05)。

2.2 外源H2S對鹽脅迫下棉花幼苗光合色素含量的影響

由圖1可知，NaCl脅迫使棉花幼苗葉片Chl a(圖1A)、Chl b(圖1B)和Chl a/b(圖1C)均明顯下降，尤其是NaCl濃度為100 mmol·L-1時顯著(p<0.05)降低了棉花幼苗葉片中各葉綠素組分含量。相同Nacl濃度下，噴施NaHS后，棉苗葉片葉綠素含量呈現出隨NaHS濃度增大而先升后降的趨勢，如同樣是在100 mmol·L-1Nacl脅迫下，T2、T3、T4處理Chl a含量較T1分別提高了4.19%、8.87%和13.45%，而T5則較T1降低了4.08%，說明外源H2S能緩解NaCl脅迫對Chl a生物合成的抑制作用，但H2S濃度過高卻降低了這種緩解效應。Chl b、Chl(a+b)變化趨勢與Chl a相似。方差分析表明，H2S濃度相同各處理下棉花幼苗葉綠素含量均隨NaCl濃度升高而顯著(p<0.05)降低；相同NaCl脅迫時棉苗Chl含量則隨外源H2S濃度升高而顯著(p<0.05)升高；NaCl與H2S互作各處理棉苗葉綠素含量與CK差異顯著(p<0.05)。

表2 外源H2S對鹽脅迫下棉花單株幼苗生物量的影響/g

2.3 外源H2S對鹽脅迫下棉花幼苗葉綠素熒光參數的影響

如圖2所示，CK棉苗各葉綠素熒光參數[qP、qN、Y(NPQ)和Y(NO)]均最高，說明NaCl脅迫對棉花幼苗PSⅡ造成了嚴重危害，抑制棉花幼苗光合作用正常進行。相同濃度NaCl脅迫條件下，隨著NaHS施入，qN、Y(NPQ)和Y(NO)均有所升高，如T4與T1相比，棉花幼苗Y(NPQ)、Y(NO)和qN分別提高了20.54%、10.14%、5.27%；K4與K1相比，Y(NPQ)、Y(NO)和qN分別提高了16.74%、2.27%、2.65%，說明外源H2S能有效抑制NaCl脅迫對棉花幼苗PSⅡ的危害，提高光能的吸收和電子傳遞速率，且以濃度為100 μmol·L-1NaHS處理效果最佳。方差分析表明，棉花幼苗qP、qN、Y(NPQ)和Y(NO)隨NaCl濃度升高而顯著下降(p<0.05)；相同NaCl脅迫處理下，棉苗qP、qN、Y(NPQ)和Y(NO)隨外源H2S濃度升高而顯著升高(p<0.05)；NaCl與H2S交互作用各處理棉花幼苗qP、qN、Y(NPQ)、Y(NO)等葉綠素熒光參數與CK間差異顯著(p<0.05) 。

2.4 外源H2S對鹽脅迫下棉花幼苗光合氣體參數的影響

由圖3A可以看出，相同濃度的NaCl脅迫條件下，Pn隨H2S濃度的增大而增大，說明外源H2S可有效緩解NaCl脅迫對光合的抑制作用，提高了棉花幼苗凈光合速率。Gs(圖3B)同Pn的變化趨勢一致，經H2S處理后，棉苗Gs逐漸升高，如T2、T3、T4、T5與T1相比分別提高了21.38%、30.17%、37.74%、25.70%，說明H2S處理能提高NaCl脅迫下棉花葉片的氣孔導度，提高葉片與外界環境對CO2的交換作用，促進光合碳同化有效運轉。Ci(圖3C)和Tr(圖3D)的CK處理測定值最大， K1與之相比，分別降低了13.28%和20.05%，說明NaCl脅迫使棉花幼苗光合作用減弱，降低了植株的光能利用率。方差分析表明，棉花幼苗的Pn、Gs、Tr和Ci隨NaCl濃度升高而顯著下降(p<0.05)；NaCl與外源H2S互作各處理下棉花幼苗的Pn、Gs、Tr和Ci均與CK間差異顯著(p<0.05)。

2.5 外源H2S對鹽脅迫下棉花幼苗抗氧化酶活性的影響

鹽脅迫使植物體內產生過多活性氧(ROS)，而POD、SOD和CAT是活性氧清除系統中的關鍵作用酶，在降低超氧陰離子和過氧化氫對植物自身膜系統的損傷中起著重要作用[14]，三者共同被稱為植物體內活性氧的清除劑。POD、SOD和CAT活性常用來作為判定植物耐鹽性的重要指標[15]。由圖4A可以看出，與CK相比，T1、K1棉花幼苗POD活性分別下降了47.03%、57.64%，說明NaCl脅迫降低了POD活性，且NaCl濃度越大抑制效應越明顯。不同濃度H2S處理(K2、K3、K4、K5)與K1相比，棉苗POD活性分別提高了23.56%、43.00%、85.02%、32.54%，說明外源H2S處理使NaCl脅迫下棉花POD活性升高，有效增強了植株抗氧化能力，從而提高了棉株抗鹽性，其中，K4處理效果最佳。

如圖4B所示，NaCl脅迫導致棉苗SOD活性顯著降低(p<0.05)，如T1較CK降低了41.75%。噴施不同濃度H2S后，棉花幼苗 SOD活性呈先升后降趨勢，以100 μmol·L-1H2S處理(T4、K4)SOD活性最高，說明外源H2S能緩解NaCl脅迫對棉花幼苗抗氧化酶活性的抑制作用，但濃度過高或過低時，緩解效果都會大大減弱。

CAT活性(圖4C)變化趨勢與POD、SOD相似，表現為NaCl脅迫使CAT活性下降，且隨NaCl脅迫加劇CAT活性下降程度越來越大，而外源H2S的加入緩解了這種效應。方差分析表明，H2S濃度相同處理下，棉花幼苗CAT活性隨NaCl濃度升高而顯著(p<0.05)降低；相同NaCl脅迫棉苗CAT活性隨外源H2S濃度升高而顯著(p<0.05)升高；NaCl與H2S交互作用，各處理棉苗CAT活性與CK差異顯著(p<0.05)。

3 討論與結論

3.1 外源H2S對鹽脅迫下棉花幼苗生長的影響

鹽脅迫減弱了植物光合碳同化的能力，使光合色素降解，從而制約了植株的生長發育，降低了植株生物量[16]。董建梅等[17]研究表明鹽脅迫抑制石榴實生苗生長，隨鹽濃度增加單株生物量呈先升后降趨勢。單長卷等[18]在對水分脅迫下的玉米種子研究中發現，外源H2S處理顯著降低了逆境脅迫對種子萌發的抑制效應，增大了玉米根長和根重，顯著降低了相對傷害率。本研究中鹽脅迫顯著降低了棉花幼苗地上部鮮、干質量及地下部干質量，外源H2S緩解棉花幼苗生長過程中NaCl脅迫帶來的抑制作用，這與董建梅[17]、單長卷等[18]的研究結果基本一致。

3.2 外源H2S對鹽脅迫下棉花幼苗光合色素含量的影響

光合色素含量是一項可以直觀反映出植物光合作用強弱程度的生理指標[19]，在對光能的吸收與利用中有著舉足輕重的作用。吳永波等[20]對白蠟樹的研究結果表明，鹽脅迫環境對葉綠素生物合成造成了次生破壞，且隨鹽濃度升高白蠟幼苗葉片葉綠素含量逐漸降低。Aslam等[21]在棉花上進行了鉛脅迫下外施H2S試驗，表明通過外源噴施H2S顯著提高了光合色素含量，與本研究結果一致，低濃度H2S有效緩解鹽脅迫引起的棉花幼苗光合色素含量的下降，能夠降低鹽脅迫對棉花幼苗光合系統的傷害，增強棉花葉片對光能的吸收和利用。

3.3 外源H2S對鹽脅迫下棉花幼苗葉綠素熒光參數的影響

葉綠素熒光能夠直接反映植物PSⅡ系統活性以及電子傳遞情況的變化。本研究顯示，隨著鹽脅迫加劇，qP、qN、Y(NPQ)、Y(NO)也隨之減小，這與彭方仁等[22]研究不同樹種幼苗的結果一致，其研究表明鹽脅迫使植株PSⅡ反應中心活性下降, 葉片受到光抑制, PSⅡ反應中心受到不同程度的損傷；前人亦有研究表明，NaCl脅迫下茄子幼苗光系統反應中心受到損傷,光合電子傳遞過程受到抑制[23]，最終導致葉綠素熒光參數下降。本研究還發現，噴施H2S后，棉花幼苗的qP、qN、Y(NPQ)、Y(NO)明顯提高，可能是由于外源H2S能有效提高PSII光化學活性，增強非環式電子傳遞效率，緩解光合機構受到的光氧化損傷。

3.4 外源H2S對鹽脅迫下棉花幼苗光合氣體參數的影響

鹽脅迫致使棉花葉片氣孔關閉、CO2進入葉肉細胞速率下降，Pn、Gs、Ci和Tr減小，棉株光合作用減弱[24]。高曉蘭[25]認為，外源H2S處理能有效提高桃樹Pn，改善葉片光合性能,并且促進了植株的形態建成。本研究中隨著鹽濃度的增加Gs顯著降低，可能是鹽離子在植株體內的不斷積累導致了葉片氣孔關閉、葉綠體結構遭到破壞，氣孔導度下降，并且由此還進一步引起了Pn下降。而H2S施入后，Pn、Gs、Ci和Tr均明顯提高，說明H2S處理能提高葉片與外界環境對CO2的交換作用，促進光合碳同化的有效運轉，提高了光合性能。這與前人[24-25]的結論基本相同。

3.5 外源H2S對鹽脅迫下棉花幼苗抗氧化酶活性的影響

鹽離子過度增加會降低植株抗氧化酶(SOD、POD、CAT等)活性，削弱其清除植株體內活性氧(ROS)的效率，使ROS逐步積累，過量ROS引起膜脂過氧化，破壞細胞膜功能，導致植物體內代謝失調[26]。鹽脅迫降低了儲藏物質分解和轉化速率，降低棉苗SOD、POD、CAT活性，造成植株體內活性氧產生和清除系統動態平衡的破壞[27]。本研究中NaCl脅迫使棉花幼苗POD、SOD及CAT活性下降，顯著降低了植株抗氧化能力，使棉株抗鹽能力減弱，這與翁亞偉[26]、李笑佳等[27]研究結論相似，但與鄭慶柱等[28]對鹽脅迫下青稞幼苗的研究結果不一致，可能是不同作物對鹽脅迫應激反應不同而造成的差異。H2S在鹽脅迫下具有通過激活抗氧化酶活性進而修復植株抗氧化還原系統的能力[29]。本研究中，隨著外源H2S的加入，棉花幼苗POD、SOD及CAT活性增大，緩解了鹽脅迫對棉株抗氧化酶系統的損傷，降低了鹽脅迫帶來的危害。

綜上所述，20～500 μmol·L-1外源H2S均能有效緩解棉花鹽害，其中尤以外源H2S濃度為100 μmol·L-1時效果最佳。H2S處理可調控鹽脅迫下棉花幼苗的生理代謝，促進其生長；通過提高葉綠素含量、葉綠素熒光參數(qP、qN、Y(NPQ)、Y(NO))及光合氣體參數(Pn、Gs、Ci和Tr)以提高光合作用強度，增強植株對光能的利用效率。本研究還發現，噴施外源H2S后，棉花幼苗qP、qN、Y(NPQ)、Y(NO)明顯提高，可能是由于外源H2S能有效提高 PS II光化學活性，增強非環式電子傳遞效率，緩解光合機構受到的光氧化損傷。同時H2S在抗氧化酶體系中作用最為明顯，通過增強抗氧化酶的活性來減少鹽脅迫導致的過氧化損傷以及活性氧自由基對機體造成的傷害，從而保護膜結構，促進棉花幼苗更好地生長發育。因此推測在鹽脅迫下外源H2S能使清除H2O2的酶類活性顯著提高，使細胞受害程度得到緩解。而H2S對鹽脅迫下棉花幼苗生長及光合特性的影響鮮有報道，因此，本試驗可為進一步闡釋棉花幼苗抗鹽機制提供一定的理論依據。