秸稈連續還田對蘇打鹽堿水稻土養分及真菌群落的影響

李紅宇， 王志君， 范名宇， 劉夢紅，呂艷東，劉麗華

(黑龍江八一農墾大學農學院，黑龍江省現代農業栽培技術與作物種質改良重點實驗室，黑龍江 大慶 163000)

中國作為一個農業大國，秸稈總產量總體上呈不斷增長之勢，在過去的幾十年里，農作物秸稈的年平均增長率約為4%[1]，中國已經成為世界上秸稈年產量最高的國家之一，但秸稈利用率卻不足 50%[2]。目前燃燒秸稈現象嚴重，造成資源浪費、環境污染，使農田生態平衡遭受破壞[3]。如何有效處理農作物秸稈已成為農業生產、環境保護面臨的緊迫問題。作物秸稈本身含有豐富的氮、磷、鉀等營養元素，秸稈還田不僅能夠解決環境污染問題，還能改善土壤結構和土壤理化性質、為土壤提供養分，從而減少肥料投入[4-7]，同時還能提高作物產量[8-9]，是農業可持續發展的有效措施之一[10-11]。

水稻是世界上重要的糧食作物，一半以上的人口以稻米為主食[12]。東北地區是我國重要的商品糧生產基地，對保障中國的糧食安全起著重要作用。而東北地區蘇打鹽堿地總面積達500萬hm2[13]，是世界三大蘇打鹽堿土集中分布區之一，與濱海或內陸鹽堿土相比，蘇打鹽堿土的pH值高、通透性差、肥力低下，從而制約其在農業上的開發利用[14]。在未來全球氣候變暖日益加劇的情景下，土壤鹽漬化問題還將日趨明顯[15]，構成對土壤和農業生產的重要威脅[16]。土壤微生物是土壤重要的組成部分，是秸稈分解、轉化以及土壤中能量和養分循環的關鍵因素[17-18]，其對外界條件(如土壤類型、pH值、作物根系分泌物等)變化十分敏感[19]，是評價土壤質量和健康狀況的重要指標之一[9]。秸稈長期還田能夠促進微生物的生長，提高微生物多樣性和酶活性[20-21]，改變群落結構[22-24]。真菌具有很強的纖維素降解能力，能降解作物秸稈中含有的纖維素、半纖維素和木質素[25]，在秸稈還田的過程中發揮重要作用[26]。

目前，關于秸稈還田對土壤改良以及土壤微生物群落影響的研究成果層出不窮，但是以水稻秸稈作為材料來研究秸稈還田對蘇打鹽堿地改良效果的報道較少，其改良機制也尚未明確。本研究探討了不同量水稻秸稈連續多年還田對土壤養分和真菌群落結構特征的影響及二者的相關關系，以期為蘇打鹽堿地土壤改良和秸稈資源的高效循環利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

黑龍江省大慶市(119°23′E，26°10′N)屬東北半濕潤—半干旱草原—草甸鹽漬區，土地鹽堿化類型以蘇打堿化草甸土、沼澤化草甸土和蘇打鹽化草甸堿土為主，土壤在鹽化的同時伴隨著堿化過程。該地年日照時數2 726 h，無霜期166 d，年平均氣溫4.2℃，夏季平均氣溫23.2℃，農作物生長發育期氣溫日差達10℃以上，年降水量427.5 mm，年蒸發量1 635 mm。

試驗于2014—2018年在大慶市黑龍江八一農墾大學校內盆栽試驗基地進行。供試土壤于2014年取自黑龍江八一農墾大學校內0～15 cm土層的蘇打鹽化草甸堿土，土壤理化性質如表1所示。供試品種為墾鑒稻5號，主莖12片葉，株高87～90 cm，需≥10℃活動積溫2 450℃～2 500℃。

表1 供試土壤養分含量(2014年)

1.2 試驗設計

采用盆栽試驗，單因素完全隨機設計，水稻秸稈每年還田量設置5個水平，分別為0(CK)、3.0(RS1)、7.5(RS2)、12(RS3) t·hm-2和16.5 (RS4) t·hm-2，3次重復，每次重復種植4盆。第1年春季將采集的鹽堿土風干、粉碎、混勻，之后取12 kg鹽堿土與長度約5 cm的定量水稻秸稈混拌均勻，裝入盆缽(盆缽高30.5 cm，內徑30 cm)，將基肥埋入土層10 cm深處，加水至水層穩定，人工攪漿模擬水整地。插秧規格為每盆4穴，每穴3苗。每年收獲后每個盆缽土壤原狀保留，春季粉碎，與秸稈混拌后裝入原盆缽。每年每處理還田量及管理措施相同，秸稈連續還田5 a。施用的肥料為尿素、硫酸銨、磷酸二銨和硫酸鉀。基肥N、P、K的施用量分別為39.6(N)、69(P2O5)、42(K2O) kg·hm-2，分蘗肥和調節肥N的施用量分別為28.35 kg·hm-2和9.35 kg·hm-2，穗肥N和K的施用量分別為14.39(N) kg·hm-2和28.5(K2O) kg·hm-2。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤取樣方法 2018年(秸稈連續還田第5年)6月中旬(水稻分蘗期)，使用土壤取樣器采集0～10 cm土壤樣品，3次重復，每次重復為4盆各3個樣點的混合樣。每份土樣分為2份，其中一份裝入無菌密封袋后，迅速置于液氮中帶回實驗室，在-80℃下保存，供土壤微生物種群結構多樣性分析；另一份置于避光通風處風干，除去砂礫石塊和植物殘體，過2 mm篩，用于土壤養分含量測定。

1.3.2 土壤基本理化性質測定 土壤pH采用電位法測定；有機質含量采用重鉻酸鉀法測定；全氮含量采用凱氏定氮法測定；堿解氮含量采用堿解擴散法測定；全磷含量采用碳酸鈉熔融—鉬銻抗比色法測定；有效磷含量采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法測定；全鉀含量、速效鉀含量采用火焰光度法測定。以上各方法均參照魯如坤[27]的方法。

1.3.3 土壤總DNA的提取、真菌ITS序列的PCR擴增及高通量測序 稱取0.5 g土樣，利用mobio土壤微生物DNA強力提取試劑盒PowerSoil?DNA Isolation Kit進行DNA提取，使用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計，對DNA的純度、濃度和完整性進行檢測。對樣本進行ITS1區域的擴增，引物為5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’。PCR擴增第一步反應體系為50 μl，反應程序：95℃預變性5 min；15個循環(包括95℃，1 min；50℃，1 min；72℃，1 min)；72℃，7 min；4℃保溫。將PCR產物用磁珠進行純化。第二步反應體系為40 μl，反應程序：98℃預變性30 s；10個循環(包括98℃，10 s；65℃，30 s；72℃，30 s)；72℃，5 min。將第二步PCR產物用磁珠純化后進行Nanodrop 2000定量，按照質量比1∶1進行混樣。采用Illumina Hiseq 2500平臺(Illumina Corporation，USA)，2×250 bp的雙端測序策略對文庫進行測序。土壤微生物總DNA的提取、測序委托北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.4 數據處理

使用USEARCH方法，對各樣品的Effective Tags進行聚類，將序列相似性達到97%的序列聚類生成操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTUs)；使用Mothur(version v.1.30)軟件對樣品Alpha多樣性指數進行評估；采用R軟件對OTU豐度進行主坐標分析(PCoA)并制圖，研究不同處理間群落結構組成差異；使用冗余分析(RDA)研究土壤理化性質和微生物群落結構之間的關系。采用Excel 2003進行數據整理，用DPS v7.05軟件進行方差分析，運用 GraphPad prism6.02 軟件完成畫圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理土壤理化性質的比較

表2結果表明，全磷、有效磷和速效鉀含量隨著秸稈還田量的增加呈增加趨勢，各處理均顯著高于對照。添加秸稈后提高了土壤pH和全鉀含量，RS1～RS4處理的pH值均顯著高于對照，全鉀含量各處理之間差異不顯著。有機質含量呈現RS4>RS3>CK>RS2>RS1，RS4處理顯著高于對照和其他處理。各處理的全氮含量均顯著低于對照，RS2和RS4處理的堿解氮含量顯著高于RS1和RS3，與對照間差異不顯著。

表2 不同處理土壤理化性質的比較

2.2 不同處理土壤真菌相對豐度的比較

排名前10的真菌門分別為子囊菌門(Ascomycota)、Aphelidiomycota、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、輪蟲門(Rotifera)、單毛壺菌門(Rozellomycota)、芽枝霉門(Blastocladiomycota)、黃藻門(Anthophyta)、毛霉亞門(Mucoromycota)。本文著重分析秸稈還田后相對豐度產生顯著差異的菌門(圖1)。子囊菌門相對豐度最高，范圍為15.731%～68.177%，秸稈還田后其相對豐度呈現增加的趨勢，RS4處理達到了最大值，顯著高于對照和其他處理。RS1處理中Aphelidiomycota、輪蟲門和黃藻門的相對豐度顯著高于對照和其他處理。RS2～RS4處理的Aphelidiomycota相對豐度顯著低于對照，輪蟲門和黃藻門相對豐度與對照間差異不顯著。隨著秸稈添加量的增加擔子菌門和被孢菌門相對豐度呈現先降低后增加的趨勢，RS4處理達到了最大值，顯著高于其他處理。

注：不同小寫字母表示Duncan多重比較不同處理在5%水平下差異顯著。下同。

進一步分析秸稈連續還田對其相對豐度影響較大的真菌屬(圖2)。相對豐度排名前三的菌屬分別為裂殼菌屬(Schizothecium)、柄孢殼屬(Zopfiella)、腐質霉屬(Humicola)，其相對豐度變化范圍為2.395%～33.368%、0.048%～16.892%、0.185%～0.722%。隨著秸稈添加量的增加，裂殼菌屬、柄孢殼屬的相對豐度呈現增加的趨勢，除了RS1處理外，其他處理均顯著高于對照。腐質霉屬的相對豐度變化趨勢為RS2>RS4>RS1>RS3>CK，其中RS2和RS4處理均顯著高于對照。添加秸稈后鏈格孢屬、枝孢屬的相對豐度幾乎都顯著低于對照，被孢霉屬的相對豐度除了RS4處理顯著高于對照外，其他處理均顯著低于對照。綜合表明RS1和RS4處理對真菌門和屬相對豐度影響較大。

圖2 不同處理對真菌屬水平上物種相對豐度的影響

2.3 不同處理土壤真菌群落多樣性的比較

在97%相似度水平下，各處理OTU數和Alpha多樣性統計結果如表3所示。樣本測序深度指數值均在99.9%以上，表明測序深度包括了樣品中的絕大多數真菌類型，測序數據量合理。真菌OTU數量在302～406之間，各處理均低于對照，其中RS2和RS4處理與對照間差異達到顯著水平。以Chao1和ACE指數衡量物種豐度即物種數量的多少，各處理的Chao1和ACE指數均顯著低于對照。Simpson和Shannon指數用于衡量物種多樣性，Shannon指數值越大，Simpson指數值越小，說明樣品的物種多樣性越高。RS1～RS4處理的Simpson值高于對照、Shannon值低于對照，除RS1外，其他處理與對照間的差異均達到了顯著水平。綜上，表明秸稈還田降低了土壤真菌OTU數目和Alpha多樣性。

表3 不同處理土壤真菌群落豐富度指數和多樣性指數

2.4 不同處理土壤真菌群落結構的比較

為研究秸稈連續還田后真菌群落結構的變化，基于OTU層次進行PCoA分析，選取貢獻率最大的主坐標組合(圖3)。第一、二主坐標軸對真菌群落結構變異的解釋量分別為19.66%和12.82%。各處理的3次重復距離較接近，表示同一處理的樣品群落結構相似度較高。RS1～RS4處理與對照明顯區分開，RS1～RS3處理在PC2軸上的投影較為接近，RS4在PC2軸上的投影與其他處理明顯區分開。說明添加秸稈改變了土壤真菌群落結構，高還田量對其影響更為顯著。

圖3 不同處理主坐標分析

將土壤理化特性與相對豐度排名前10的真菌屬進行RDA分析(圖4)，明確影響群落結構變化的環境因子。圖中射線與射線之間的關系由夾角表示，鈍角代表負相關，銳角代表正相關。RDA分析表明，2個主要軸特征值分別為18.74%和 12.13%。腐質霉屬與全鉀、pH、有效磷、全磷、速效鉀含量成正相關，柄孢殼屬、裂殼菌屬除了與上述環境因子呈正相關外，還與有機質、堿解氮含量成正相關。被孢霉屬與全磷、速效鉀、有機質、堿解氮以及全氮含量呈正相關，鏈格孢屬、枝孢屬與堿解氮以及全氮含量呈正相關。針對土壤真菌區系結構和土壤理化指標的Mantel test結果表明(表4)，全磷、有效磷、全鉀、速效鉀以及有機質含量與真菌群落結構差異達到了顯著和極顯著水平，其中有效磷和速效鉀含量對群落結構的影響最大。

注：TP：全磷；AK：速效鉀；OC：有機質；AN：堿解氮；TN：全氮；TK：全鉀；AP：有效磷。Schizothecium：裂殼菌屬；Mortierella：被孢霉屬；Alternaria：鏈格孢屬；Phlebopus：脈柄牛肝菌屬；Cladosporium：枝孢屬；Endochytrium：內囊壺菌屬；Humicola：腐質霉屬；Zopfiella：柄孢殼屬。

3 討 論

3.1 秸稈連續還田對蘇打鹽堿水稻土理化性質的影響

作物秸稈本身含有豐富的氮、磷、鉀等營養元素，還田后養分得到釋放，能夠改善土壤肥力狀況和養分循環[4,6]。已有大量的研究表明秸稈還田可以顯著提高速效養分的含量[9,28-29]。本研究發現秸稈連續還田5 a后，全磷、有效磷和速效鉀含量隨著秸稈還田量的增加呈增加趨勢，均顯著高于對照。Su等[30]在秸稈長期還田試驗中也得到了相同的結論。分析原因是秸稈中含有較多的鉀，且主要是以K+形態存在，還田后隨著土壤淋溶逐漸轉移到土壤溶液中再被土壤吸附。磷含量和有效磷增加的原因一是秸稈中含有磷，二是由于長期秸稈還田的投入可能帶入大量有機物料促進土壤有機質積累，土壤有機質可以促進活性形態磷的積累，降低非活性磷素占總磷的比重[31]。本試驗秸稈還田后，土壤中的全氮含量顯著低于對照，因為水稻秸稈中C/N顯著大于微生物自身的C/N，微生物除了合成自身生長所需要的C/N，為了利用多余的碳，會繼續從土壤中吸收氮，從而造成土壤總氮和堿解氮的損失[22]。所以在秸稈還田的同時配施適量氮肥，使植物秸稈更易分解，快速轉化成土壤中的養分，從而提高作物產量[32]。

表4 Mantel 檢驗分析

秸稈本身所含有的豐富有機成分和營養元素，通過秸稈還田可作為土壤有機質的有效補充，對土壤有機質含量的增加產生顯著的正效應。已有大量研究指出，秸稈還田能夠增加土壤有機質含量[28,33-34]。本研究結果表明，參試土壤有機質基礎值為18.0 g·kg-1，連續秸稈還田5 a后，不還田對照及各秸稈還田處理土壤有機質含量均大幅度提高，但是還田量0、3.0、7.5、12 t·hm-2處理之間差異并未達到顯著水平，顯著低于還田量為16.5 t·hm-2處理。同時發現各個處理的pH值均顯著高于對照，還田量3.0 t·hm-2的pH值最高。這與李鵬[22]、Zhang[35]等研究結果一致，即秸稈還田增加了土壤的pH值。添加秸稈和生物炭后土壤的pH值呈現增加的原因可能是他們本身的堿含量[36-37]。水稻秸稈分解后堿基陽離子的釋放，主要是鉀的釋放，是土壤pH值升高的主要原因[35]。也有學者研究指出秸稈還田后土壤的pH值降低[24,38]，或者沒有顯著變化[39]。這可能是作物秸稈和土壤本身的pH值不同，以及秸稈還田方式和還田時間的不同造成了試驗結果的不同。

3.2 秸稈連續還田對土壤真菌相對豐度的影響

秸稈還田為土壤中的微生物提供了豐富的碳源和多種養分元素，有利于微生物的生長繁殖以及活性的提高。水稻秸稈中含有大量的纖維素、半纖維素和木質素[25]，真菌具有很強的纖維素降解能力，在秸稈還田的過程中發揮重要作用[26]。本文著重分析了生物炭還田后相對豐度發生顯著變化的菌門和菌屬。子囊菌門、 接合菌門、擔子菌門為土壤三大常見真菌類[24,32]。本研究中排名前三的菌門為子囊菌門、Aphelidiomycota、擔子菌門。無論是短期的培養試驗還是長期的定位試驗，都發現添加秸稈后子囊菌門的相對豐度顯著增加[24,40]。本研究也得到了相同的結論，即秸稈還田增加了子囊菌門的相對豐度。代紅翠等[41]研究發現秸稈雙季還田擔子菌相對豐度高于單季還田，說明擔子菌門的相對豐度受到秸稈還田量的影響。本研究中當還田量為16.5 t·hm-2時，擔子菌門的相對豐度顯著高于其他處理。Aphelidiomycota相對豐度僅次于子囊菌門，它不是典型的土壤真菌，相關報道較少[42-43]，有待于進一步研究。本研究發現秸稈還田增加了一些菌門菌屬相對豐度的同時也降低了部分菌門菌屬的相對豐度，推測原因有兩方面：一是添加秸稈后改變了土壤的理化性質，從而促進或抑制了部分菌門和菌屬的生長；二是添加秸稈后提高了分解纖維素的微生物活性[40],例如子囊菌已被證明能夠降解纖維素和木質纖維素[44]。

3.3 秸稈連續還田對土壤真菌多樣性的影響

真菌構成了土壤的大部分微生物生物量，其具有分解有機質、為植物提供養分的功能，是生態系統健康的指示物[45]。土壤真菌的多樣性決定了生態系統的多樣性和植物生產力[46]。長期添加秸稈能夠提高和豐富土壤真菌群落，從而改善土壤特性[40]。李鵬等[22]發現水稻秸稈還田270 d和360 d后顯著增加了土壤真菌的群體數量和多樣性指數，即添加秸稈能夠增加真菌群落的豐富度和多樣性[11,32]。也有研究認為添加秸稈降低了真菌和細菌的OTUs豐富度和多樣性[24]。本研究也得到了相同的結論即添加秸稈后降低了土壤中真菌的OTU數和Alpha多樣性。微生物群落的豐度和多樣性很大程度上取決于土壤的pH值和營養狀況[47-48]，通常pH值升高抑制微生物生長，導致其群落多樣性下降[49]。本試驗所用的土壤為蘇打鹽堿土，添加秸稈后pH值高達8.64，對真菌生長產生了抑制作用。另一方面可能水稻秸稈的C/N比較大，添加到土壤后導致土壤中的C/N升高，土壤中沒有足夠的氮素提供真菌活動，從而降低了土壤真菌的多樣性。

3.4 秸稈連續還田對土壤真菌群落結構的影響

土壤微生物群落的多樣性和結構對環境變化特別敏感，所以能夠很好地反映土壤質量變化[11]。秸稈還田增加了土壤外源有機碳源，對真菌群落有很大的影響[50]。李鵬等[22]研究指出土壤有機碳、pH值和速效磷是引起土壤真菌群落結構及多樣性變異的主要因素。前人關于秸稈還田的短期培養試驗和長期的大田試驗均發現添加秸稈能夠改變真菌的群落結構[23-24]。本研究的PCoA分析表明添加秸稈處理與對照明顯區分開，說明秸稈添加改變了土壤真菌群落結構，其中高秸稈還田量對其影響更為顯著。本研究通過RDA和Mantel 檢驗分析表明，全磷、有效磷、全鉀、速效鉀以及有機質含量與真菌群落結構差異達到了顯著和極顯著水平。土壤微生物對外界條件十分敏感，如土壤類型、土壤pH值、溫度和濕度、作物根系分泌物等[19]。本試驗中秸稈還田改變了土壤中的有機質和氮磷鉀含量，所以推測秸稈還田后土壤理化性質發生改變，進而影響微生物群落結構與多樣性。

4 結 論

1)秸稈還田明顯提高了土壤有機質、磷、鉀含量，從而改善土壤的養分狀況，16.5 t·hm-2(RS4)處理改良效果尤為顯著；

2) 秸稈還田顯著提高了部分土壤真菌門和菌屬的相對豐度，其中3.0 t·hm-2(RS1)和16.5 t·hm-2(RS4)處理提高效果尤為顯著；

3)秸稈還田降低了真菌Alpha 多樣性，改變了真菌的群落結構，全磷、有效磷、全鉀、速效鉀以及有機質含量是影響土壤微生物群落結構差異的重要環境因子。表明秸稈還田能夠調節土壤的理化性質，從而影響真菌的群落結構。