化妝品中耐熱大腸菌群和金黃色葡萄球菌檢測能力驗證分析

孫廷麗, 李彩玲，劉靜霞，王青柏，周少璐，謝小保

廣東省科學院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心，華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室， 廣州 510070

化妝品因其含水量高、營養豐富等特點，特別容易發生微生物的污染。化妝品中微生物的污染，不僅會引起產品的質量下降，造成經濟上的損失，也可能會對消費者的健康造成威脅。因此，微生物的質量控制和檢測是保障化妝品衛生安全的重要環節[1]。耐熱大腸菌群主要來自人和溫血動物糞便，國內外許多標準都會選用此類菌作糞便污染指標來評價化妝品的衛生質量，推斷化妝品中是否有污染腸道致病菌的可能性[2]，金黃色葡萄球菌則是能引起人體局部化膿性疾病、敗血癥等的一種條件致病菌，也是化妝品污染中常見的一類微生物[3]。因此，這兩類菌也作為不得檢出的致病菌，被列為《化妝品安全技術規范》(2015版)化妝品的微生物常規檢驗項目[4]。對上述兩類菌的檢測結果的準確性和可靠性，是實驗室檢測能力的重要組成部分。能力驗證作為一種外部質量控制的手段，是考察實驗室檢測能力的有力手段，可以有效的檢驗實驗室的測試水平[5]。為提高實驗室的質量控制水平和考察實驗室的檢驗能力，實驗室參加了由中國檢驗檢疫科學研究院組織的能力驗證，并對能力驗證實施過程和結果進行了跟蹤分析，對實驗室如何提高檢測準確性和有效實施耐熱大腸菌群和金黃色葡萄球菌內部質量控制提出了建議。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1試驗樣品

采用ACAS-PT743能力驗證樣品。樣品為白色凍干塊狀，為人工污染的化妝品樣品，包裝于真空西林瓶中，由中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心提供。樣品批號為ACAS-PT743(2019)，其中瓶號分別為19-M195、19-N405的樣品用于耐熱大腸菌群的檢測，瓶號19-C154,19-D117用于檢測金黃色葡萄球菌。

1.1.2培養基及儀器

標準菌株大腸桿菌(E.coli)ATCC25922及金黃色葡萄球菌(S.aureus)ATCC 6538來源于美國模式菌種保藏中心(American Type Culture Collection)；雙料乳糖膽鹽培養基、蛋白胨、伊紅美蘭培養基(EMB)、SCDLP培養基、Baird-Parker培養基、血平板、甘露醇發酵培養基、靛基質試驗生化管、革蘭氏染色液、血漿凝固酶等微生物培養及鑒別培養基均購自廣東環凱生物技術有限公司；氯化鈉，分析純，購自廣州化學試劑廠；DNA提取試劑盒，MEGA；2X Taq PCR mix，北京全式金生物；HFsafe-1500生物安全柜(100級)，北京哈爾東聯儀器制造有限公司；隔水式恒溫培養箱，生化培養箱，高壓蒸汽滅菌器，購自廣東環凱生物技術有限公司；PCR擴增儀，美國ABI公司。

1.2 試驗方法

按照ACAS-PT742(2019)《化妝品中耐熱大腸菌群和金黃色葡萄球菌檢測能力驗證》作業指導書和《化妝品安全技術規范》(2015版)[4]進行耐熱大腸菌群和金黃色葡萄球菌的分析和鑒定。同時，采用 16S rDNA基因測序的方法對可疑菌株進行鑒定，最終綜合以上試驗結果出具報告。試驗中，分別將大腸桿菌ATCC25922及金黃色葡萄球菌ATCC 6538制成約102CFU/mL的菌懸液，作為對照菌株進行陽性對照實驗。

1.2.1樣品前處理

無菌條件下開啟樣品西林瓶，立即加入21 mL滅菌生理鹽水，充分溶解混勻，制成待檢樣品原液。取10 mL原液加入90 mL無菌生理鹽水中，混勻，制成1∶10檢液。上述過程注意保持無菌并充分混勻。

1.2.2耐熱大腸菌群的檢驗

分別取10 mL 1∶10 檢液和10 mL大腸桿菌菌懸液加到10 mL雙料乳糖膽鹽培養基中，置(44.5±0.5)℃培養24 h，觀察結果。如產酸產氣，則取一環培養物，劃線EMB培養基，并繼續于36 ℃培養24 h，同時接種1～2滴培養物到蛋白胨水中，置44.5 ℃培養24 h，觀察結果。EMB培養基上觀察是否存在典型菌落形態的菌株，如有可疑菌株，則實施革蘭氏染色進行鏡檢；使用24 h蛋白胨水培養物進行靛基質試驗。對可疑的菌落進行16S rDNA序列鑒定，結合《化妝品安全技術規范》中規定的生化指標特征綜合報告結果。

1.2.3金黃色葡萄球菌的檢驗

分別取10 mL 1∶10檢液和10 mL金黃色葡萄球菌菌懸液加到90 mL SCDLP培養基中，充分混勻，置(36±1)℃培養24 h，觀察結果。則取一環培養物，劃線BP平板，并繼續于(36±1)℃培養24 h，取典型單菌落再次接種于血平板上，于(36±1)℃培養24 h，挑取可疑單菌落進行革蘭氏染色，甘露醇發酵實驗及血漿凝固酶實驗。對可疑的菌落進行16S rDNA序列鑒定，結合《化妝品安全技術規范》中規定的生化指標特征綜合報告結果。

1.2.416SrDNA序列鑒定方法

使用DNA快速提取試劑盒提取菌落DNA，并使用16S rDNA通用引物(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’、5’-AAG GAG GTG ATG CAG CCG CA-3’)對提取的DNA序列進行擴增(體系為2 μL 模板，上下游引物各1 μL，2X Taq PCR Mix 25 μL，ddH2O補足至50 μL；擴增條件為95 ℃ 預變性4 min；95 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸90 s，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存備用)。對擴增的序列進行序列測定。測序委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行。測序后，用Blast程序(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在Genbank中與已登錄的序列進行核苷酸同源性比較，以相似度最高的一種或幾種細菌作為鑒定候選菌種。

2 結果與討論

2.1 試驗結果

2.1.1耐熱大腸菌群

按照《化妝品安全技術規范》(2015版)第五章3耐熱大腸菌群的檢測方法對19-M195、19-N405進行檢測，檢測結果見表1。

表1 耐熱大腸菌群檢測結果

從表1結果可知，樣品19-M195與19-N405在進行雙料乳糖膽鹽發酵時均出現了產酸產氣的現象，進一步的生化實驗中，劃線EMB平板后，19-M195的樣品平板上出現了兩種菌落，一種具備典型的耐熱大腸菌群的形態特征，另一種為紅色的圓形菌落，為非典型的耐熱大腸菌群生長特征。而19-N405的EMB培養則呈現典型的耐熱大腸菌群鑒別特征。對可疑菌落進行進一步的生化鑒定，并對其進行16S rDNA分子鑒定，結果證實，在19-M195中分離出的兩種菌分別為大腸埃希氏菌(99%)及肺炎克雷伯氏菌(99%)，19-N405中分離到的菌種為大腸埃希氏菌(99%)。兩個樣品中均檢出了耐熱大腸菌群目標菌。

2.1.2金黃色葡萄球菌

按照《化妝品安全技術規范》(2015版)第五章5金黃色葡萄球菌的檢測方法對19-C154,19-D117進行檢測，檢測結果見表2。

表2 金黃色葡萄球菌檢測結果

從上表結果可知，能力驗證中給出的兩個樣品，都含有微生物，其中19-C154上的菌落在血平板上不溶血，不具備金黃色葡萄球菌的典型特征，染色觀察為革蘭氏陽性，鏈球菌，基本可以排除檢出金黃色葡萄球菌的可能性。為進一步驗證該結果，對其進行了16S rDNA鑒定，結果證實為糞腸球菌(99%)，該樣品中未檢出金黃色葡萄球菌；樣品19-D117中的目標菌在BP平板、血平板上呈現典型的金黃色葡萄球菌生長特征，革蘭氏染色成葡萄串狀陽性球菌，甘露醇發酵陽性，能在l2 h內凝固血漿。上述生化特征表明，19-D117中含有目標金黃色葡萄球菌，16S rDNA的鑒定結果也證明了這一結論。

2.1.3能力驗證結果及反饋

測試結束后，上報本實驗室測試結果，能力驗證滿意。根據中國檢驗檢疫科學院的反饋結果，參加耐熱大腸菌群能力驗證的共56家實驗室，共發出82個陽性樣品和30個陰性樣品，結果不滿意的實驗室結果為假陰性，滿意率98.2%；參加耐熱大腸菌群能力驗證的共60家實驗室，共發出82個陽性樣品和30個陰性樣品，結果不滿意的實驗室結果為假陰性，滿意率98.8%。

2.2 討論

綜合分析實驗室本次及歷次參加能力驗證的樣品情況、試驗流程及檢測過程中的質量控制情況，認為存在以下對化妝品中耐熱大腸菌群和金黃色葡萄球菌的檢測結果準確性的影響因素：

1) 培養基是微生物檢驗質量控制的重要組成部分，培養基的質量對最終結果的判斷影響極大。金黃色葡萄球菌檢測過程中使用的BP培養基及血漿凝固酶的質量對最終結果的判定都有較大的影響。檢測過程中注意使用的培養基及試劑的質量，做好試劑的技術驗收工作及使用過程中的質量控制工作，是實驗室得到準確試驗結果的基礎[6-8]。

2) 能力驗證的樣品可能存在一定的均一性和穩定性的差異，在收到樣品后，應按照要求存儲并盡快檢測[9]，不當的存儲環境或樣品取樣不均一，都有可能導致結果出現假陽性或假陰性。同時，實驗室應注意樣品前處理的過程，干粉西林瓶開瓶加水后需立即進行取樣檢測，化妝品作為一種營養豐富的實驗基質，存放過長時間容易引入其它微生物污染，從而造成假陽性的結果。

3) 標準中對耐熱大腸菌群及金黃色葡萄球菌的培養及鑒定過程中規定，培養時間為24 h～48 h，故培養過程中如特征不明顯的，應繼續培養足夠時間，以免菌落特征不典型，造成誤判。耐熱大腸菌群的檢測溫度要求為(44.5±0.5)℃，對溫度的要求比較高，如果實驗室溫度控制偏差過大，則可能影響結果，此處最好使用隔水式恒溫培養箱。

4) 現實中受檢的化妝品樣品，可能同時存在多種微生物污染，即會存在干擾菌或者非典型特征菌落，特別是目標菌株可能不是第一優勢菌群的情況下，應細心判斷，結合多種手段進行確認，不能主觀預判，以免出現錯誤。與此同時，標準規定的鑒別指標，也大多是針對特定類群的某一種典型菌種設置的，也可能導致其它非典型菌落被忽略。以耐熱大腸菌群為例，耐熱大腸菌群是指包含了大腸埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬和克雷伯菌屬在內的一類腸道致病菌的統稱，而依據化妝品安全技術規范中規定的生化指標，僅大腸埃希氏菌符合全部典型特征，其它多種耐熱大腸菌群的菌種則被排除[10]。故檢測中分離到的菌種，如菌種特征不顯著，應特別注意結合多種手段進行檢驗，而不能僅僅根據形態特征或部分生化鑒定特征進行判斷，以免出現假陰性。目前微生物檢測技術日新月異，許多的新的技術手段如 PCR[11]、等溫擴增技術[12]、飛行質譜分析[13]、熒光光電分析[14]及其它檢測技術手段[15,16]，都可以作為有效的輔助測試，排除假陰性或假陽性結果。

5) 實驗過程應加強質量控制，注意使用陽性對照菌，方便直觀的判斷結果。為防止遺漏出現假陰性結果，應多選幾個可疑菌落進行鑒定，以更準確的出具結果。

3 結論

根據能力驗證的結果反饋情況，可以發現，實驗室具備并保持了檢出化妝品中耐熱大腸菌群和金黃色葡萄球菌的能力。在實施化妝品進行耐熱大腸菌群及金黃色葡萄球菌的檢測時，比較容易發生假陰性的結果。

為預防假陽性或假陰性結果的出現，應加強質量和檢驗過程的控制。定期參加能力驗證，并參照能力驗證樣品制備實施實驗室內部質量控制的盲樣或考核樣品，有助于全方位的檢測實驗室的技術能力，提高實驗室技術水平。