硫酸化酵母葡聚糖對雞球蟲病的防治效果

劉 博，陳 融，2，陳 凱，彭 鼎，2，王 米*

(1.中國農業科學院上海獸醫研究所農業農村部獸用化學藥物及制劑學重點實驗室，上海 200241；2.長江大學，荊州 434023)

雞球蟲病是一種嚴重的寄生蟲病，可引起雞輕度至嚴重的病變，給畜牧業造成沉重負擔，長期困擾著養禽業，不利于經濟的增長。據估計，世界范圍內每年養殖雞群約有210億只，產生1.1萬億個雞蛋和約900億kg雞肉，但球蟲病會降低雞蛋和肉類的產量，并在全球每年造成約20億英鎊的損失[1-3]。根據球蟲的分類，不同的球蟲寄生在雞體內不同的部位。球蟲病可以導致雞的營養損失、腸壁出血性炎癥和上皮脫落或徹底破壞，導致大量出血和死亡[4]。在不斷與雞球蟲病的抗爭中，人們雖然開發出了許多有效的抗球蟲藥和球蟲病疫苗，在控制疾病方面取得了很大進展，但是也出現了很多問題，比如藥物殘留和微生物耐藥性問題[5]。此外，給家禽大量使用化學類抗球蟲藥物后，一些藥物會通過排泄物原樣排泄，并可以轉移到農田中，污染了食物來源，并對環境、植物、土壤造成了極大的污染[6]。在家禽飼料中使用化學類藥物及一些抗生素會對家禽、人類健康、食品安全及環境造成潛在的不利影響，因此，全球范圍實施了完全禁止或限制使用抗生素的方案，并尋找能在畜禽業使用的綠色安全藥物[7]。開發新的即能抗雞球蟲病又綠色安全、無污染殘留的藥物，日益受到人們的關注。

多糖是自然界中普遍存在的生物大分子，具有多種生物和藥理活性。多糖的來源非常廣泛，比如可以來源于光合作用較高的植物、真菌、藻類、細菌等，不同來源的多糖因其具有不同的的生物學活性而備受關注，如一些多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗糖尿病、抗輻射、抗病毒、降血脂、免疫調節等功能[8-9]。腸道微生物在食物能量的獲取、儲存和消耗中起著重要的作用，動物飼料中也常常添加細菌，如添加雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、球菌屬、鏈球菌屬、酵母菌株釀酒酵母和克魯維酵母屬來增加動物的體重增長，研究表明，益生菌在促進生長方面相當于或優于抗生素[10]。球蟲感染會破壞雞盲腸屏障和破壞菌群多樣性，使雞盲腸內的乳酸桿菌的數量大量減少，同時，機會病原體也會不斷增加[11-12]。多糖可充當益生元的角色，可以作為底物被益生菌利用，可以促進腸道益生菌的生長[13]。另外，也有研究表明，一些多糖對小鼠體內球蟲感染有一定的作用[14]。因此，對多糖進行研究具有重要的意義。

多糖經過硫酸化修飾，可以改變其結構，進而改變其生物活性功能，如硫酸化可以改善多糖對巨噬細胞的吞噬作用，還能改善多糖的抗氧化，抗腫瘤、抗炎的作用[15-18]。本試驗擬探討硫酸化酵母葡聚糖(sGSC)對感染球蟲的雞的影響，通過分析雞的體重、臟器指數、卵囊排除情況及腸道菌群變化，以探究sGSC是否具有抗球蟲的作用，是否具有被開發為抗球蟲藥物的潛力，為后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

浦東三黃小公雞，購自上海匯中種雞場，1日齡購入， 飼養在經過嚴格消毒的無球蟲房間，14 d后開始分組。全價飼料委托上海祥興有限公司加工,飼料中不添加任何藥物。飲水為RO 水(reverse osmosis water)。

1.2 蟲株

柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊(Eimeriatenella)，由本研究室自備，4 ℃冰箱保存。

1.3 葡聚糖的準備

硫酸化酵母葡聚糖，由中國農業科學院上海獸醫研究所獸用抗感染藥物團隊所制。

1.4 分組與處理

200只雞隨機分為A、B、C、D和E組，每組4籠， 每籠10只雞。分組完成后，A、B、C組分別在飲水中添加sGSC，用量分別為 4、16、和64 mg· kg-1，D組和E組飲用RO水，連續3 d后，除了E組, 對其余各組雞只人工經口感染柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊(每只雞經口灌入卵囊1 mL，每毫升包含3萬個孢子化卵囊)。

1.5 臨床觀察

試驗期間每日觀察各組雞的精神狀態、飲食飲水情況、有無血便、有無死亡等情況，并準確記錄下來。如果試驗期間出現雞死亡，應進行解剖，觀察其病理變化，判斷其死亡原因[19]。

1.6 感染雞的卵囊檢查

感染后第4天清除各組雞的糞便，換上新的報紙，收集第5、6天的糞便，收集的糞便按組別混合攪拌均勻，分別稱取2 g糞便至燒杯中，加水稀釋至60 mL， 攪拌均勻，各取1 mL稀釋液后加入2 mL飽和鹽水，振蕩混勻后充入麥克馬氏計數板計數室，靜止3 min后在顯微鏡下計數，計算每克糞便中的卵囊數，計算公式為OPG= [(n1+n2)/(2×0.15)]×3×60÷2。

1.7 器官指數分析

感染后第7天對每只雞稱重，剖殺所有雞，觀察盲腸病變，計算心、肝、胸腺和法氏囊的臟器指數，計算公式: 器官指數= 器官鮮重/宰前活重×100%。

1.8 腸道菌群分析

腸道內容物的DNA提取和高通量測序。剖殺雞后，從每組中取3只雞，在無菌條件下分別取其盲腸，分離腸道內容物，從盲腸中提取總微生物DNA，通過PCR擴增16S rRNA基因的V3-V4區域，然后在Illumina MiSeq / NovaSeq平臺上測序。本工作由上海派森諾公司完成。

1.9 數據的統計分析

2 結 果

2.1 臨床表現情況

D組雞在感染球蟲第3天出現精神萎靡，羽毛凌亂現象，采食量明顯減少，感染后第4天下午出現血便；第5天血便更加嚴重，雞群呈現精神沉郁和嗜睡等癥狀。此外，試驗期間，A、B、C、D 4組各死亡1只， 對每只死雞進行剖檢，發現腸道出現病變，盲腸內出現血液或血樣凝塊和盲腸顯著萎縮，腸黏膜變厚。E組雞的精神狀況良好，糞便顏色正常，無死亡。

2.2 體重變化分析

由圖1可知，球蟲感染后，D組中雞的終末體重表現為明顯降低，與E組相比差異極顯著(P<0.01)。 飲水中添加sGSC的各組雞中，A組(4 mg·kg-1) 雞的體重顯著低于E組(P<0.05)，B組(16 mg·kg-1)和C組(64 mg·kg-1)中雞的體重有所恢復，雞體重與E組體重無統計學差異(P>0.05)， 說明恢復至接近E組水平。

2.3 卵囊排出情況

由于E組雞未排出卵囊，故對A、B、C、D 4組進行分析。由圖2可以看出，感染后第5天，A組(4 mg·kg-1) 與D組排出卵囊數相近，而B組(16 mg·kg-1) 和C組(64 mg·kg-1)雞排出的卵囊數較低，其中，C組(64 mg·kg-1)排出的卵囊數最少。感染后第6 天，A、B、C、D 4組的卵囊數逐漸接近。各組雞排出卵囊的變化在統計學上均無明顯差異(P>0.05)。

A、B、C、D、E后面的數字1、2、3分別代表初始雞體重、攻蟲時雞體重和終末雞體重。*代表P<0.05，有統計學差異，**代表P<0.01有顯著統計學差異，***代表P<0.001有極顯著差異，沒有*代表無統計學差異，下圖同The numbers 1, 2, and 3 behind A, B, C, D, and E represent the initial weight of the chicken, the weight of the chicken at the time of attack, and the weight of the final chicken, respectively. * means P<0.05, there is a statistical difference, ** means P<0.01, there is a significant statistical difference, *** means P<0.001, there is a very significant difference, no* means no statistical difference, the same as below圖1 sGSC對雞體重的影響Fig.1 The effects of sGSC on chicken body weight

圖2 sGSC對雞卵囊排出的影響Fig.2 The effect of sGSC on the excretion of chicken oocysts

2.4 臟器指數分析

對各組雞的臟器指數進行分析。由圖3可知，與E組相比，球蟲感染后導致D組的雞出現肝指數、脾指數顯著升高(P<0.05)，但胸腺指數顯著降低(P<0.05),而心和法氏囊指數在統計學上均無明顯變化。與D組相比，除了B組(16 mg·kg-1)的肝指數有所降低(P<0.05)，其余組的臟器指數無明顯差異(P>0.05)。此外，與D組相比，A組(4 mg·kg-1) 中雞的胸腺指數明顯升高(P<0.05)，趨向于恢復至健康對照組的水平。

圖3 sGSC對雞臟器指數的影響Fig.3 The effects of sGSC on the organ index of chicken

2.5 盲腸菌群變化分析

在本研究中，通過Illumina系統分析了腸道菌群多樣性。稀疏曲線的平緩程度反映了測序深度對于觀測樣本多樣性的影響大小，曲線越平緩，表明測序結果已足夠反映當前樣本所包含的多樣性，稀疏曲線圖4a表明，每個樣品均可以完全捕獲腸道菌群的測序深度，均可以用于進一步分析。以Chao1、Observed species指數表征豐富度，Shannon指數表征多樣性，Pielou’s evenness指數表征均勻度，進行了分析，各指數數值越大，則說明物種豐富度越高、數量越多、或物種分布越均勻。圖4c 分析了Chao1指數、Pielou_e指數、Observed_species指數和Shannon指數，發現各指數在統計學上均無明顯差異(P>0.05)。用主坐標分析(PCoA)對各組菌群進行分析，圖4b中左下角最小三角形代表E組，與E組相比，其余各組在橫坐標上的投影與E組距離基本相等，但A、B、C組與D組在縱坐標上的投影有所不同，說明SGSC對雞腸道菌群產生了影響。

在科的水平上，對各組雞盲腸微生物的分類學組成變化進行了分析，在科的水平上，比較有代表意義的菌群變化主要有Veillonellaceae、Lactobacillaceae和Enterococcaceae(表1和圖4 d)。結果顯示，sGSC能提高盲腸內Veillonellaceae和Lactobacillaceae的相對豐度，降低Enterococcaceae的相對豐度，表明sGSC對雞盲腸內的微生物結構組成產生了有利的改變。

3 討 論

家禽主要用于生產供人食用的肉和蛋，其中，雞是最重要的家禽之一，在全球范圍內被人們廣泛飼養，雞能提供動物源性蛋白質，在改善人們的營養方面發揮出了巨大的作用，在世界經濟發展中具有極其重要的地位[20]。球蟲病嚴重威脅家禽業，在全世界范圍內造成了重大的經濟損失，全球每年由球蟲病造成的經濟損失估計為30億美元，由于抗生素和一些化學藥物具有負面作用，研發新型綠色安全的抗球蟲藥物尤為重要[21]。

球蟲感染對雞的生理狀況帶來巨大的影響，會使雞的精神狀態下降，體重減輕，采食量下降，柔嫩艾美耳球蟲還能造成腸損傷，削弱腸屏障的完整性，也能改變雞腸道內的致病菌和非致病菌[21-22]。球蟲感染會在雞腸道內產生高水平的氧化和炎性應激，嚴重影響雞的生長發育，甚至造成死亡[23]。雞胃腸道中的微生物群能提高從飲食中獲取能量的效率，具有重要的作用，肉雞盲腸和空腸中的菌群具有極高飼料轉化能力，能間接影響雞的體重[24]。葡聚糖具有抗炎、抗氧化、提高免疫力和改善腸道菌群的作用[25-27]，因此，預測sGSC或具有一定的抗球蟲作用。在本試驗中，將sGSC提前3 d飲水飼喂雞，持續至結束，探究提前飲水飼喂sGSC對柔嫩艾美耳球蟲感染的影響。結果發現，sGSC能改善柔嫩艾美耳球蟲感染對雞的影響，表現為減輕了受感染雞盲腸的病理變化，使血便減少，給糖濃度為16和64 mg·kg-1體重時，雞排出卵囊數出現減少，同時sGSC也促進了受感染雞體重的恢復，并改善了胸腺指數和脾指數。

a.稀疏曲線；b. PCoA分析；c.α多樣性分析；d.物種組成分類分析a. Sparse curve; b. PCoA analysis; c. α diversity analysis; d. Species composition classification analysis圖4 sGSC對雞盲腸內微生物的影響Fig.4 The effects of sGSC on the microbes in the cecum of chickens

表1 每組盲腸內細菌組成在科水平上的不同

本研究對雞盲腸內微生物變化也進行了分析。結果顯示，柔嫩艾美耳球蟲感染使雞盲腸內的Veillonellaceae相對豐度減少為0，而給糖濃度為4 mg·kg-1時，A組中盲腸內Veillonellaceae的相對豐度提升至0.2%，但仍然低于E組的0.74%。有研究表明，Veillonellaceae是一種有益的細菌，營養不良的病人腸道中Veillonellaceae豐度會減少，Veillonellaceae也可以將琥珀酸酯轉化為丙酸酯，影響丙酸的形成及糖酵解[28]。Lactobacillaceae是一種益生菌[29]，感染柔嫩艾美耳球蟲后，雞盲腸內Lactobacillaceae豐度降低為0，但是在給糖濃度為16 mg·kg-1時，Lactobacillaceae豐度則恢復至0.27%，但仍低于E組的8.37%。Enterococcaceae與發熱和腹瀉有關，危害比較嚴重[30]，在本研究中，E組Enterococcaceae豐度為0.感染對照組Enterococcaceae豐度為11.94%，A、B、C等給糖組的Enterococcaceae相對豐度分別降為0.92%、0.71% 和4.73%，說明sGSC減少了雞盲腸中Enterococcaceae的相對豐度。以上結果均可說明，sGSC對雞腸道菌群具有有益的調節作用。

4 結 論

sGSC能改善柔嫩艾美耳球蟲感染對雞群帶來的不利影響，并且對感染雞的腸道菌群具有一定的調節作用。