底物和環境因子對魚源腐敗希瓦氏菌和假單胞菌生長動力學的影響

朱琳,郭全友

1(中國水產科學研究院東海水產研究所,上海,200090) 2(華威大學 生命科學學院,英國,CV4 7AL)

2019年,全國水產品產量總計6 480.36萬t,比上年增長0.35%[1]。較之畜禽類食品,水產品不僅味道鮮美、脂肪含量低,還含有豐富的DHA、EPA、牛磺酸等營養成分,因而受到消費者喜愛[2]。然而,水產品具有高水分和高蛋白的特點,在貯運過程中極易腐敗變質,其中微生物是引起腐敗的主要原因[3]。鮮魚在捕撈和運輸過程中,微生物可通過魚的腮部、體表黏液、破損的表皮和腸道等侵入機體并不斷增殖,分解營養物質,產生胺類、酯類、硫化物等腐臭特征的產物,導致魚肉原有形態、色澤和風味產生劣變[2,4]。這一過程中,魚體內只有部分適合生存和繁殖的菌群參與腐敗,并產生腐敗臭味和異味代謝產物,成為該產品的特定腐敗菌[4-5]。

水產品中最常見的腐敗菌包括腐敗希瓦氏菌、明亮發光桿菌、乳酸菌和假單胞菌[5-7]。腐敗希瓦氏菌屬于革蘭氏陰性好氧菌,能夠產生H2S、三甲胺(trimethylamine,TMA)及生物胺等[6],是大黃魚[8]和大菱鲆[9]等海產品的特定腐敗菌。假單胞菌是冷藏羅非魚[10]和鯉魚[11]等淡水魚的特定腐敗菌。腐敗菌在導致不同魚類腐敗的過程中,初始菌數和腐敗速率是影響產品貨架期的主要因素,初始菌數主要與魚類棲息水域相關,而腐敗速率主要由溫度、pH、鹽分和魚種類等因素決定。水產品在加工過程中常采用低溫處理、降低水分活性、酸化、降低氧化還原值和添加防腐劑等措施調控目標微生物的生長活動[12],因此,選擇高效和針對性的控菌抑菌手段成為研究熱點。

本文以源自有氧低溫貯藏的大黃魚和羅非魚的特定腐敗菌腐敗希瓦氏菌和假單胞菌為對象,探究其在底物、溫度、pH和NaCl影響下的生長動態,采用Gompertz方程擬合生長曲線,分析環境因子和強度對其最大比生長速率(μmax)和遲滯期(λ)的影響,為深入了解微生物生存的生態系統變化對細菌產生的脅迫作用和響應機制提供基礎,為靶向抑菌和延長產品貨架期等提供支撐。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

原料：腐敗希瓦氏菌(Shewanellapulrefaciens)和假單胞菌(Pseudomonasspp.)分別從大黃魚和羅非魚中分離、篩選、鑒定并于4 ℃斜面冷藏。

試劑：胰蛋白胨大豆胨肉湯(tryptone soybean peptone broth TSB)、胰蛋白胨大豆胨瓊脂(tryptone soybean peptone agar,TSA),英國OXOID；NaCl,上海市國藥集團化學試劑有限公司；1 mol/L HCl溶液,深圳市博材達科技有限公司。

1.2 儀器與設備

pH計(pHS-3C),上海雷磁儀器廠；低溫培養箱(MIR-153,253),日本三洋公司；潔凈工作臺(SW-CJ-1FB),上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 接種物的制備

取斜面保藏的菌株接入裝有4 mL生理鹽水的比濁管中,當接種量達到108CFU/g時,依次進行10倍梯度稀釋至102～103CFU/g,然后接種到TSB和魚塊中,魚塊接種方法參照文獻[13]。

1.3.2 實驗設計

研究不同底物(TSB、大黃魚、大菱鲆、鯉魚和羅非魚)、pH(4、5、6、7)、NaCl質量分數(0.5%、2.0%、3.5%)和溫度(0、8、15、25 ℃)條件下腐敗希瓦氏菌和假單胞菌的生長曲線和動力學參數,于TSA上計數。

研究底物對菌株生長影響時,溫度設定為5 ℃,腐敗希瓦氏菌分別接種在TSB、大黃魚、大菱鲆和鯉魚魚塊上,假單胞菌接種在TSB、鯉魚和羅非魚魚塊上；研究pH和NaCl對菌株生長影響時,使用1 mol/L HCl溶液調整TSB的pH值為4、5、6和7,調節NaCl質量分數為0.5%、2.0%、3.5%和5.5%,腐敗希瓦氏菌假單胞菌和接種在TSB中15 ℃培養；研究溫度對菌株生長影響時,調整TSB的pH值為7,NaCl質量分數為0.5%,腐敗希瓦氏菌和假單胞菌接種在TSB中分別于0、8、15和25 ℃培養。

1.3.3 生長曲線擬合

采用Gompertz方程[14]對細菌生長進行擬合。

(1)

式中：t,時間,h；N(t),t時的菌數(CUF/g),初始菌數N0(lgCFU/g),最大菌數Nmax(CFU/g);μmax,最大比生長速率,h-1;Lag,延滯期,h,。

描述溫度對μmax的影響時采用Belehradek方程[15]：

(2)

式中：T,攝氏溫度,℃；Tmin,生長的最低溫度,即在此溫度時最大比生長速率為零；b,常數。

1.3.4 統計分析

使用SPSS(17.0 version)統計軟件對實驗數據進行單因素方差分析及最小顯著差異法分析,當P>0.05 時差異不顯著。實驗數據用SPSS(17.0 version)統計軟件進行回歸并求得置信區間。

2 結果與分析

2.1 底物對腐敗希瓦氏菌和假單胞菌生長的影響

將接種于不同底物的腐敗希瓦氏菌增殖過程中的生長數據進行擬合(圖1),生長動力學參數見表1。結果顯示,腐敗希瓦氏菌在大黃魚中生長的λ最長,在鯉魚和大菱鲆中λ無明顯差別；腐敗希瓦氏菌在鯉魚中的μmax最小,說明在鯉魚中的腐敗速率最慢,在大菱鲆和大黃魚中的腐敗速率接近。

圖1 底物對腐敗希瓦氏菌生長的影響Fig.1 Effect of substrate on the growth of S.putrefaciens

表1 底物對腐敗希瓦氏菌和假單胞菌生長動力學參數的影響Table 1 Effect of substrate on the growth kinetic parameters of Shewanella putrefaciens and Pseudomonas spp.

將接種于不同底物的假單胞菌生長過程中的數據進行擬合,如圖2所示,生長動力學參數見表1。結果顯示,假單胞菌在鯉魚和羅非魚中的μmax和λ均無明顯差異。另外,在鯉魚中,腐敗希瓦氏菌與假單胞菌的μmax相當,說明2種菌株在鯉魚中的腐敗能力相近,這與許振偉等[16]研究中得出的結論,鯉魚魚塊中假單胞菌的產量因子略大于腐敗希瓦氏菌一致。

圖2 底物對假單胞菌生長的影響Fig.2 Effect of substrate on the growth of Pseudomonas spp.

2.2 pH和NaCl對腐敗希瓦氏菌和假單胞菌生長的影響

分別接種腐敗希瓦氏菌到pH為4、5、6、7,NaCl質量分數為0.5%、2.0%和3.5%的TSB中,于15 ℃培養,結果顯示pH為4和5時,腐敗希瓦氏菌不生長。6個實驗組(N1～N6)的環境條件及生長曲線見

圖3，生長動力學見表2。在所有NaCl質量分數下,pH為7時的μmax均大于pH為6時。另外,NaCl質量分數對腐敗希瓦氏菌的μmax和λ影響顯著,隨NaCl分量分數升高,μmax整體呈下降趨勢,λ整體呈延長趨勢,說明NaCl質量分數在0.5%～3.5%,腐敗希瓦氏菌的增殖力隨NaCl質量分數升高而逐漸減弱。

表2 各組環境條件及其腐敗菌生長動力學參數Table 2 Environmental conditions of each experimental group and their growth kinetic parameters

圖3 不同NaCl質量分數下pH對腐敗希瓦氏菌生長的影響Fig.3 Effect of pH on the growth of S.putrefaciens under various NaCl concentrations

分別接種假單胞菌到pH為4、5、6、7,NaCl質量分數為0.5%的TSB中,于15 ℃培養,pH為4和5時假單胞菌不生長。通過接種假單胞菌到pH為6和7的TSB中,溫度和NaCl質量分數相同,對其生長進行擬合得到圖4。表2顯示,在本實驗條件下,pH對假單胞菌的生長沒有顯著影響。

圖4 pH對假單胞菌生長的影響Fig.4 Effect of pH on the growth of Pseudomonas spp.

修艷輝等[17]的研究發現,pH和NaCl對腐敗希瓦氏菌的μmax和λ有較大影響,在15和25 ℃環境下,pH≤5.0時腐敗希瓦氏菌不生長,與本實驗得到的結果一致。儀淑敏等[18]的研究表明,銅綠假單胞菌的最適生長pH均為5,在pH 2～5下生長緩慢,在pH 5～8下生長良好,在pH 8以上生長緩慢。與本實驗結果有差異,原因可能是本實驗使用的假單胞菌菌株分離自羅非魚,而羅非魚貨架期終點時,假單胞菌中以熒光假單胞菌為主,其占比遠大于銅綠假單胞菌[10]。關于pH對熒光假單胞菌生長的影響的研究則鮮有報道。

2.3 溫度對腐敗希瓦氏菌和假單胞菌生長的影響

表3為不同溫度條件下腐敗希瓦氏菌(8、15、25 ℃)、假單胞菌(0、5、10 ℃)的生長動力學參數,圖5為其生長曲線。結果顯示,溫度是影響腐敗希瓦氏菌和假單胞菌生長的重要因素,在本實驗條件下,2種菌株的μmax均隨溫度升高而明顯增加；腐敗希瓦氏菌的λ隨溫度升高小幅縮短,假單胞菌的λ隨溫度升高大幅縮短。使用Belehradek方程描述溫度和2種腐敗菌μmax之間的關系,腐敗希瓦氏菌：y=0.040 6x+0.055 5,R2=0.983 5; 假單胞菌：y=0.016 2x+0.133 8,R2=0.997 6。結果表明,溫度與腐敗希瓦氏菌和假單胞菌μmax之間線性關系的R2分別為0.983 5和0.997 6,均處在 95%置信區間內,表明該置信區間內能較好描述溫度與2種菌最大比生長速率的關系。

表3 各組溫度條件及其腐敗菌生長動力學參數Table 3 Temperature conditions of each experimental group and their growth kinetic parameters

a-腐敗希瓦氏菌;b-假單胞菌圖5 溫度對腐敗希瓦氏菌和假單胞菌生長的影響Fig.5 Effect of temperature on the growth of S.putrefaciens and Pseudomonas spp.

朱彥祺等[19]以冷藏大黃魚特定腐敗菌腐敗希瓦氏菌為研究對象,其在5 ℃環境中生長趨勢受到明顯抑制,當溫度上升到25 ℃時,腐敗希瓦氏菌的λ顯著縮短,且溫度與λ以及μmax均存在線性關系；李媛惠[20]對雞肉中的假單胞菌進行了研究,認為溫度對假單胞菌生長有一定的影響；范新光[21]研究發現分離自鮮切西蘭花的假單胞菌μmax隨著溫度的上升而增大,λ隨溫度的上升而減小。本實驗得到的結果與前幾位研究者一致。

2.4 底物、pH、NaCl質量分數和溫度等因子的相互影響

由表2和表3可知,在溫度為15 ℃不變時,N1(pH 6.0,NaCl 0.5%)和N6(pH 7.0,NaCl 3.5%)在不同的pH和NaCl質量分數條件下有相近的μmax,但λ有顯著差距。另外,在pH 6.0不變時,N3(15 ℃,NaCl 2.0%)、N5(15 ℃,NaCl 3.5%)和S1(8 ℃,NaCl 0.5%)在不同溫度和NaCl質量分數條件下有較為接近的μmax,同時λ有差距。其內在原因有待深入研究,一方面,本實驗需要重復進行更多的平行實驗來減小誤差,從而加強實驗結果的可信度。另一方面,結果初步表明,腐敗菌在增殖過程中,溫度、pH和食鹽等因子相互影響,使生長情況更加復雜。例如,溫度升高導致腐敗希瓦氏菌生長的NaCl質量分數范圍變寬,修艷輝等[16]的研究發現15 ℃時,腐敗希瓦氏菌的生長/非生長界限為NaCl≥7%,25 ℃時,界限升至NaCl≥12%。另外,溫度會影響水的電離,從而影響底物的酸堿度。鹽濃度對于pH值也有影響,添加0.2 mol/L NaCl時,糞產堿菌(Alcaligenesfaecalis)的pH值生長范圍變寬,溫度升高,底物酸度也增加。溫度、水分活度和底物營養間存在一定關系,微生物處在最適生長溫度時,水分活度范圍最廣,營養物質增多,微生物能夠存活的水分活度范圍變廣[22]。

3 結論

魚源腐敗希瓦氏菌和假單胞菌的生長動態、抑制效應與能源(如底物)、環境因子(如溫度、pH)等緊密相關。本文基于腐敗希瓦氏菌和假單胞菌在不同條件下的生長數據,擬合生長曲線,探究了環境因子對兩種腐敗菌生長的影響。結果表明:底物差異對腐敗希瓦氏菌影響較為明顯,其在大黃魚中生長的λ最長,在鯉魚中的μmax最小,假單胞菌在鯉魚和羅非魚中的μmax和λ均無明顯差異；pH對腐敗希瓦氏菌和假單胞菌影響較為顯著,pH為4和5時兩者均不生長,pH為7時腐敗希瓦氏菌生長速率高于pH為6時,而假單胞菌生長無明顯差異；NaCl質量分數對腐敗希瓦氏菌生長影響顯著,在0.5%～3.5%,腐敗希瓦氏菌的增殖能力隨NaCl質量分數升高而逐漸減弱；溫度是影響腐敗希瓦氏菌和假單胞菌生長的重要因素,兩種菌株的增殖均隨溫度升高而增強。本研究結果發現各項環境因子之間能夠相互影響,因此對于底物、溫度、pH、NaCl相互影響的效果與機制須進行深入研究。

同時,基于水產品自身營養、風味特性和貯運條件等考慮,在設定腐敗菌調控因子及調控范圍時,需充分考慮對產品品質的影響。例如可考慮結合冰溫保鮮和氣調保鮮等物理方法,既能有效延長貨架期,又能減少對食品品質的不良影響,旨在為靶向抑菌和延長產品貨架期等提供了參考。