米酒生香酵母的分離篩選鑒定及其性能研究

李澤洋, 伍時華, 龍秀鋒*, 吳軍, 易弋

1(廣西科技大學 生物與化學工程學院,廣西 柳州,545006) 2(廣西糖資源綠色加工重點實驗室,廣西 柳州,545006) 3(廣西科技大學 教學質量監控與評估中心,廣西 柳州,545006)

米酒具有蜜香清雅、入口柔綿、落口爽凈的特點,深受消費者的喜愛[1]。米酒主體香氣成分為乙酸乙酯、乳酸乙酯和β-苯乙醇[2],主要是由微生物在米酒釀造過程中代謝產生。用于釀酒的生香酵母具有產生芳香化合物的能力,在酒的釀造過程中發揮著重要作用。生香酵母分泌的酯酶能使酵母代謝產生的醇類和酸類物質發生反應生成多種具有香味的酯類物質[3]。β-苯乙醇則通過艾利希途徑代謝調節而產生[4]。生香酵母多存在于酒曲或水果當中,其種類多樣,常見的生香酵母有異常畢赤酵母(Pichiaanomala)[5-6]、漢遜酵母(Hansenula)[7]、假絲酵母(Candida)[8]、異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)[9]和接合酵母(Zygosaccharomyces)[10]等。優良生香酵母的篩選、研究不但可以應用于酒類釀造,對醬油[11-12]、醋[13-15]和腌菜[16]等的發酵也具有積極作用。

為得到米酒釀造中產香能力突出的酵母,通過嗅聞法初篩得到產香味明顯的純菌株,再通過測定其發酵米酒過程中乙酸乙酯、乳酸乙酯、β-苯乙醇和乙醇的積累量復篩得到產香最突出的菌株,并對其進行形態學和分子生物學鑒定,進一步探究其發酵米酒產生的風味物質,及添加前體物對其發酵米酒中風味物質形成的影響。

1 材料與方法

1.1 原料

秈米：市售,保存完好,無霉無蛀。

菌種來源：通過多種途徑得到11種不同篩菌原料,如表1所示。

表1 原料樣品信息Table 1 Information of the samples of raw material

1.2 試劑

孟加拉紅培養基,廣東環凱生物科技有限公司；酵母粉、蛋白胨,賽默飛世爾科技有限公司；葡糖淀粉酶、α-淀粉酶,滄州夏盛酶生物技術有限公司；L-苯丙氨酸,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。以上均為生化試劑

乙酸乙酯、乙醇、β-苯乙醇、乳酸乙酯,均為色譜純，上海凜恩科技發展有限公司；L-乳酸(高純),上海麥克林生化科技有限公司；乙酸(分析純),成都市科龍化工試劑廠；葡萄糖(分析純),天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.3 培養基

孟加拉紅培養基(g/L)：蛋白胨5,葡萄糖10,KH2PO41,MgSO40.5,瓊脂15,孟加拉紅0.033,氯霉素0.1。115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂(yeast extract peptone dextrose,YPD)培養基(g/L)：葡萄糖20,酵母粉10,蛋白胨20,瓊脂15,自然pH。115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基(g/L)：馬鈴薯200(去皮切塊,加水煮沸20 min,收集濾液),葡萄糖20,瓊脂15,自然pH。115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

種子培養基(g/L)：葡萄糖20,酵母粉10,蛋白胨20,自然pH。每200 mL分裝至500 mL三角瓶,115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

發酵培養基：秈米打粉,以10 U/g米添加α-淀粉酶,95 ℃液化4 h,以150 U/g米添加葡糖淀粉酶,65 ℃糖化4 h,以料液比=1∶4(g∶mL)補足水,每200 mL分裝至500 mL三角瓶,105 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.4 儀器與設備

BX43生物顯微鏡,日本奧林巴斯有限公司；Tpersonal聚合鏈式反應儀,德國Biometra公司；DYY-6D型電泳儀,北京市六一儀器廠；ZXSD-R1430生化培養箱、ZWYR-C2402C智城恒溫培養振蕩器、ZHJH-C1112C超凈工作臺,上海智城分析儀器制造有限公司；LDZH-100KBS立式壓力滅菌器,上海申安醫療器械廠；賽里安456GC氣相色譜儀(TM-930色譜柱：25 m×0.53 mm,1 μm),荷蘭賽里安儀器(scion instruments)公司；TRACE 1300-ISQQD氣相色譜質譜聯用儀(色譜柱HP5-MS 30 m×0.25 mm,0.25 μm),賽默飛世爾科技有限公司；H2100R醫用離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.5 實驗方法

1.5.1 種子培養

種子液：將菌落挑取一環接入種子培養基,30 ℃、150 r/min培養18 h。

1.5.2 初篩

取5.0 g樣品溶于45 mL無菌水中混勻,靜置取上層菌懸液,以10倍系列稀釋制備10-3、10-4、10-5、10-6、10-7菌懸液,分別移取100 μL涂布于孟加拉紅平板培養基,30 ℃培養,分離、劃線純化出具有典型酵母菌菌落特征的菌株,接種于YPD斜面培養基,4 ℃保存備用。

將純化得到的酵母劃線于PDA平板培養基,30 ℃培養3～4 d,通過嗅聞法篩選出使平板具有明顯香味的菌株。

1.5.3 復篩

將初篩得到的酵母以10%(體積分數)的接種量接種于發酵培養基,在30 ℃、150 r/min條件下培養7 d,利用氣相色譜儀測定乙酸乙酯、乳酸乙酯、β-苯乙醇及乙醇的含量,取樣平行測定3次。

樣品處理：樣品經11 000 r/min、4 ℃離心15 min,取上清液。

GC條件：初始溫度50 ℃,3 ℃/min升至80 ℃,保持2 min,再以5 ℃/min升至180 ℃,保持2 min,進樣口溫度180 ℃,檢測器溫度210 ℃,進樣量0.5 μL,分流比20∶1。

1.5.4 菌株的鑒定

1.5.4.1 形態學鑒定

將篩選出的菌株劃線于YPD平板培養基,30 ℃培養3 d,觀察菌落及其微觀形態特征,參考《真菌鑒定手冊》[17]進行形態學鑒定。

1.5.4.2 分子生物學鑒定

引物：ITS1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′),ITS4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。

PCR反應體系：預混酶25 μL；引物ITS1、ITS4各2 μL；菌液2 μL；ddH2O 19 μL。擴增條件：預變性94 ℃、5 min;變性94 ℃、1 min;退火55 ℃、1 min;延伸72 ℃、1 min,循環30次;再延伸72 ℃、10 min,4 ℃保存。

取PCR擴增產物,進行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳條帶切膠回收,送至廣州賽默飛世爾科技公司測序。測序結果提交于美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的GenBank數據庫進行BLAST序列比對,使用軟件Mega 5.0,并采用鄰接法構建系統發育樹。

1.5.5 菌株發酵風味物質測定

將復篩得到的菌株的發酵液進行風味物質測定。

樣品處理：4 ℃、11 000 r/min離心15 min,取上清液和二氯甲烷各30 mL于250 mL三角瓶中,置于搖床(100 r/min)萃取60 min,繼續加入20 mL二氯甲烷萃取30 min,最后加入10 mL二氯甲烷萃取10 min。萃取結束后使用分液漏斗分液,收集下層溶液并減壓濃縮至5 mL,使用氣相色譜質譜聯用儀測定風味物質。

程序升溫：40 ℃保持5 min,以5 ℃/min升至180 ℃保持5 min,再以5 ℃/min升至240 ℃保持2 min；進樣口溫度280 ℃；氦氣流速1 mL/min；進樣量1 μL；不分流進樣。

質譜條件：離子源溫度300 ℃；傳輸通道溫度為280 ℃；電離方式為EI電離源；電子能量70 eV；質譜掃描范圍40～600 amu。

1.5.6 香氣前體物對菌株釀造米酒香氣物質的影響

利用GC測定發酵液中乙酸乙酯、乳酸乙酯和β-苯乙醇的積累量,取樣平行測定3次。

GC條件：初始溫度40 ℃,3 ℃/min升溫至70 ℃,保持3 min,再以10 ℃/min升至180 ℃,保持2 min,進樣口溫度200 ℃,檢測器溫度230 ℃,進樣量0.5 μL,分流比20∶1。

1.5.6.1 乙酸對菌株釀造米酒乙酸乙酯積累量的影響

在發酵培養基中分別添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%(體積分數)的乙酸(0.22 μm濾膜過濾),以體積分數10%的接種量接種,在30 ℃、150 r/min條件下培養10 d,每天測定發酵液中乙酸乙酯積累量。

1.5.6.2L-苯丙氨酸對菌株釀造米酒β-苯乙醇積累量的影響

在發酵培養基中分別添加0、2、4、6、8、10 g/L的L-苯丙氨酸(滅菌前添加),以體積分數10%的接種量接種、在30 ℃、150 r/min條件下培養10 d,每天測定發酵液中β-苯乙醇積累量。

1.5.6.3L-乳酸對菌株釀造米酒乳酸乙酯積累量的影響

在發酵培養基中分別添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%(體積分數)的乳酸(0.22 μm濾膜過濾),以體積分數10%的接種量接種,在30 ℃、150 r/min條件下培養10 d,每天測定發酵液中乳酸乙酯積累量。

1.6 數據處理

利用Origin 2018、Excel Microsoft 365對實驗數據進行統計分析,分析結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 生香酵母的初篩

從11種樣品中分離純化得到20株酵母菌,如表2所示,將其分別在PDA平板劃線30 ℃培養,經嗅聞初篩得到香氣突出的菌株6株,分別為2Z1、10Z1、10Z2、10Z3、11Z1和11Z6。

表2 原料中酵母菌分離純化結果Table 2 Results of isolation and purification of strains from raw materials

2.2 生香酵母的復篩

將初篩得到的菌株以體積分數10%的接種量接種到發酵培養基,在30 ℃、150 r/min條件下培養7 d,使用氣相色譜儀進行乙酸乙酯、β-苯乙醇、乳酸乙酯和乙醇積累量測定,結果見表3。

表3 初篩菌株發酵米酒香氣物質及乙醇含量 單位：g/L

由表3可知,發酵7 d的菌株11Z1發酵液中乙酸乙酯積累量最高,達到(2.833±0.260)g/L,其次為菌株11Z6和10Z2,其余菌株發酵雖產乙酸乙酯,但積累量明顯較低,均低于0.05 g/L。徐麗萍[18]從滬型大曲中篩選出一株產酯漢遜酵母,經條件優化產酯積累量可達到1.479 g/L,而菌株11Z1在未優化的條件下產酯含量明顯優于此菌株。與其他發酵液相比,菌株11Z1發酵液中β-苯乙醇積累量最高,達到(0.301±0.028)g/L,積累量明顯突出。菌株10Z2發酵液中乳酸乙酯積累量最高,達到(0.170±0.015)g/L,其次為菌株11Z6,其余均相對較低。菌株2Z1發酵液中乙醇積累量最高,其次為菌株11Z1、10Z1、11Z6、10Z3和10Z2,最低仍可達到(27.445±2.164)g/L；乙醇既可作為香氣物質的前體物,又對米酒發酵酒精度的提高有積極作用。綜合分析,菌株11Z1發酵產乙酸乙酯、β-苯乙醇的能力均優于其他菌株,且產乳酸乙酯及乙醇的能力較強,因此篩選出菌株11Z1進行進一步研究。

2.3 菌株11Z1的鑒定

2.3.1 菌株11Z1的形態學鑒定

將菌株11Z1在PDA平板中劃線,30 ℃培養3 d,觀察菌落形態及顯微形態,其結果如圖1所示。菌株11Z1菌落大且厚,濕潤黏稠易挑起,質地均勻,邊緣整齊,呈乳白色,通過顯微鏡可觀察細胞呈卵圓形,細胞個體較大,直徑約5.53～10.57 μm,出芽生殖,無鞭毛及假絲。

圖1 菌株11Z1的菌落形態及顯微形態(400倍)Fig.1 Colony morphology and micromorphology of strain 11Z1

2.3.2 菌株11Z1的分子生物學鑒定

將菌株11Z1測序結果在NCBI進行BLAST比對,并采用鄰接法構建系統發育樹,結果如圖2所示。根據BLAST比對,菌株11Z1與CyberlindnerafabianiiAMC CF002(KU962046.1)相似性達到99.83%,且在系統發育樹中聚于同一分支,可以確定菌株11Z1為Cyberlindnerafabianii。此種酵母并非常見的生香酵母,多存在于水果之中[19-23],國內外對此種酵母生香性能的研究較少,深入研究具有一定的價值。

圖2 采用鄰接法構建菌株11Z1與相關分類群系統發育樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree of strain 11Z1 and related taxa constructed注：Bar表示每單位核苷酸替換數為0.02

2.4 菌株11Z1發酵主要風味物質分析

利用GC-MS對復篩得到的菌株11Z1的發酵液進行發酵代謝風味物質分析,結果如表4所示。菌株11Z1釀造米酒產生的主要風味物質共21種,包括醇類5種、酯類3種、酸類5種、酚類1種、酮類1種、烷烴類2種、其他類4種,其中異丁醇、異戊醇、正戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、乳酸乙酯、苯甲酸和2-甲基丁酸都是酒類發酵中常見香味物質[24-25],對增加酒的香氣及酒體風格的形成具有積極作用。

2.5 添加不同的前體物對菌株11Z1釀造米酒香氣成分的影響

在培養基中添加不同的前體物(乙酸、L-苯丙氨酸和L-乳酸),以體積分數10%的接種量接種菌株11Z1,30 ℃、150 r/min培養10 d,研究前體物對菌株11Z1發酵米酒香氣成分的影響。

2.5.1 添加乙酸對菌株11Z1釀造米酒乙酸乙酯積累量的影響

乙酸乙酯具有果香味,對酒的風味起著重要作用。可嘗試通過添加乙酸乙酯前體物來增加乙酸乙酯的含量。本研究通過在發酵培養基中分別添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%(體積分數)的乙酸,每天測定發酵液中乙酸乙酯的積累量,研究乙酸對菌株11Z1發酵米酒香氣成分的影響,結果如圖3所示。

表4 C.fabianii 11Z1發酵主要風味物質Table 4 Main flavor compounds of C.fabianii 11Z1

圖3 外源添加乙酸釀造米酒過程中乙酸乙酯積累量Fig.3 Accumulation of ethyl acetate during fermenting rice wine with the addition of acetic acid

由圖3可知,不添加乙酸進行發酵時,發酵5 d乙酸乙酯積累量達到最大值,為(3.43±0.89)g/L。加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%(體積分數)的乙酸進行發酵時,分別發酵5、7、9、10和10 d乙酸乙酯積累量達到最大值,分別為(3.78±0.15)、(7.49±0.58)、(8.95±0.28)、(7.69±0.55)和(1.98±0.24)g/L,除添加0.5%乙酸外,乙酸乙酯最高積累量均大于不添加時,依次提高了10.01%、118.06%、160.71%和123.84%。基本符合積累量逐天上升而后下降的趨勢。由此可知,添加體積分數0.3%的乙酸,發酵9 d更加有利于乙酸乙酯的積累。

2.5.2 添加L-苯丙氨酸對菌株11Z1釀造米酒β-苯乙醇積累量的影響

微生物細胞中的艾利希途徑可使L-苯丙氨酸通過氨基酸的轉氨作用生成苯丙酮酸,再脫羧成苯乙醛,而后生成β-苯乙醇,或在脫羧酶作用下形成苯乙胺,再通過氧化形成苯乙醛,進而生成β-苯乙醇[26-28]。在發酵過程中可嘗試通過添加L-苯丙氨酸,利用微生物代謝提升β-苯乙醇的含量。本研究在發酵培養基中分別添加0、2、4、6、8和10 g/LL-苯丙氨酸,每天測定發酵液中β-苯乙醇的積累量,研究L-苯丙氨酸對菌株11Z1發酵米酒香氣成分的影響,結果如圖4所示。

圖4 外源添加L-苯丙氨酸釀造米酒過程中β-苯乙醇積累量Fig.4 Accumulation of β-phenylethanol during fermenting rice wine with the addition of L-phenylalanine

由圖4可知,不添加L-苯丙氨酸進行發酵時,β-苯乙醇積累量明顯低于其他處理,最大值達到(0.36±0.015)g/L,且發酵后每天的β-苯乙醇積累量并無明顯變化。當培養基中加入2、4、6、8和10 g/L的L-苯丙氨酸,分別在發酵4、4、5、4和4 d時,β-苯乙醇積累量達到最高,分別為(0.96±0.05)、(1.07±0.01)、(1.08±0.06)、(1.14±0.05)和(1.09±0.04)g/L,基本符合先增加而后減少并趨于穩定的趨勢,與不添加相比，最大積累量分別提高了166.39%、197.39%、199.09%、215.48%和201.00%,由此可知，添加8 g/L的L-苯丙氨酸,發酵4 d更加有利于β-苯乙醇的積累。

2.5.3 添加L-乳酸對菌株11Z1釀造米酒乳酸乙酯積累量的影響

酒中的乳酸乙酯具有消除水味、增加濃厚感的作用,對酒的風味尤其是口感起著重要作用。可嘗試添加乳酸乙酯前體物乳酸來增加乳酸乙酯的含量,本研究在發酵培養基中分別添加體積分數為0%、1%、2%、3%、4%和5%的L-乳酸,每天測發酵液中乳酸乙酯積累量,研究乳酸對菌株11Z1米酒發酵香氣成分的影響,結果如圖5所示。

圖5 外源添加L-乳酸釀造米酒過程中乳酸乙酯積累量Fig.5 Accumulation of ethyl lactate during fermenting rice wine with the addition of L-lactic acid

由圖5可知,不添加L-乳酸進行發酵時,發酵4 d乳酸乙酯積累量達到最大值,為(0.08±0.009)g/L。加入體積分數為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%L-乳酸進行發酵時,分別在發酵5、5、6、8和9 d達到最大值,積累量分別為(0.13±0.014)、(0.14±0.010)、(0.16±0.014)、(0.19±0.014)和(0.16±0.008)g/L,與不添加相比最大積累量依次提高了64.21%、75.52%、107.08%、144.04%和103.78%。基本符合積累量逐天上升達到最大值而后下降的趨勢。由此可知,添加體積分數0.4%的L-乳酸,發酵8 d更加有利于乳酸乙酯的積累。

目前消費者更加關注天然產品,歐洲國家法律規定,從生產原料到最終產品都是“天然的”,才可以稱“天然”。當前,市場上的乙酸、L-苯丙氨酸和L-乳酸基本上都是采用微生物發酵法或酶法生產[29-31],天然且價格低,適用于生產。采用菌株11Z1發酵米酒,同時加入天然前體物或前體物產生菌,能達到提高米酒香氣成分含量的效果,可同時滿足消費者對產品風味及產品“天然”性的要求,具有良好的市場發展前景。

3 結論

從不同來源的酒曲及水果中通過嗅聞法初篩得到6株產香味突出的菌株,通過復篩得到產乙酸乙酯和β-苯乙醇均突出且具有產乳酸乙酯和乙醇能力的菌株11Z1,經鑒定菌株11Z1為Cyberlindnerafabianii。

對菌株11Z1進行發酵風味物質分析,主要風味物質共21種,包括醇類5種、酯類3種、酸類5種、酚類1種、酮類1種、烷烴類2種和其他類4種,對增加酒的香氣,酒體風格的形成具有積極作用。

分別在培養基中添加前體物乙酸、L-乳酸及L-苯丙氨酸,研究其對菌株11Z1發酵風味物質的影響,結果表明,添加體積分數為0.3%的乙酸發酵9 d,乙酸乙酯積累量最高,達到(8.95±0.28)g/L；添加8 g/L的L-苯丙氨酸發酵4 d,β-苯乙醇積累量最高,達到(1.14±0.05)g/L；添加體積分數為0.4%的L-乳酸發酵8 d,乳酸乙酯積累量最高,達到(0.19±0.014)g/L。與不添加前體物相比,乙酸乙酯、β-苯乙醇和乳酸乙酯最高積累量分別提高了160.71%、215.48%和144.04%。