hsa_circ_0003188對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的影響

梁甲武 胡巍 屈爽 袁一方 郭斌

牙周炎導(dǎo)致的牙槽骨缺損，不僅會(huì)影響患者的口頜系統(tǒng)功能，增加義齒修復(fù)、種植體修復(fù)等臨床治療難度，還影響患者的全身健康及生活質(zhì)量[1]。因此，牙槽骨再生成為廣大患者的需求及醫(yī)生的研究熱點(diǎn)。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)因具有自我更新和多向分化潛能，成為一類優(yōu)質(zhì)的組織再生細(xì)胞來源。然而，hBMSCs在牙周炎環(huán)境中的骨再生能力是否受到影響及相關(guān)機(jī)制尚不清楚。為此，本研究體外模擬牙周炎環(huán)境，運(yùn)用芯片技術(shù)檢測正常環(huán)境與炎性環(huán)境中hBMSCs的circRNAs差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)hBMSCs在炎性環(huán)境中高表達(dá)hsa_circ_0003188。通過hsa_circ_0003188對hBMSCs成骨分化能力的影響，為改善骨組織工程效果提供理論依據(jù)，為實(shí)現(xiàn)牙槽骨再生提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

α-MEM和胎牛血清(Gibco，美國)；TNF-α(300-01A, PeproTech，美國)；BMSCs成骨誘導(dǎo)液(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)；hsa_circ_0005045過表達(dá)慢病毒(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；TriZol(Invitgen，美國)； PrimeScript RT試劑盒、SYBR PreMixExTaqTMⅡ(Takara，日本)； hsa_circ_0003188、GAPDH、ALP、OCN、RUNX2引物(上海生工生物技術(shù)有限公司)；RIPA緩沖液(Sigma，美國)；兔抗人RUNX2、兔抗人ALP、兔抗人OCN、GAPDH(Cell Signal Technology，美國)；化學(xué)發(fā)光試劑盒(amersham Biosciences, 英國)；芯片檢測(上海康成生物工程有限公司)；Western Blot成像系統(tǒng)(Tanon5500，上海天能)；倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯，日本)。

1.2 方法

1.2.1 hBMSCs分離和培養(yǎng) 采取健康志愿者的新鮮骨髓10 mL，采用密度梯度離心法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，接種在含α-MEM+10%胎牛血清、2 mmol/L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的75 mm2培養(yǎng)瓶中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)。隔天換液，觀察貼壁細(xì)胞的生長情況。細(xì)胞生長至單層融合后，胰酶消化后傳代培養(yǎng)。所有患者均已知情同意，研究方案通過中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審查(編號： S2019-066-01)。……