肝硬化患者腸黏膜屏障功能變化與Toll樣受體4、T細胞亞群的相關性分析

顧新紅 馬小麗

肝硬化（Cirrhosis）是由一種或多種原因引起的以肝組織彌漫性纖維化、假小葉和再生結節為組織學特征的進行性慢性肝病。失代償肝硬化患者門靜脈高壓導致腸道淤血、腸粘膜屏障受損、腸道菌群易位，產生菌血癥、內毒素血癥，導致全身性炎癥狀態及多個器官功能受損。目前對Toll樣受體4（TLR-4）、T細胞亞群與肝硬化患者腸粘膜屏障功能受損相關性研究比較少。現收集85例肝硬化患者的臨床資料，分析不同階段肝硬化患者腸黏膜屏障功能與TLR-4、T細胞亞群的相關性，報道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集我院消化內科2016年8月～2020年8月收治的不同病因的85例肝硬化患者臨床資料，其中男60例，女25例，平均年齡（63.41±8.15）歲。按照Child-Pugh 肝功能評分分為3組，觀察1組（Child-Pugh A級，n=28），觀察2組（Child-Pugh B級，n=29），觀察3組（Child-Pugh C級，n=28）。入選標準：根據既往病史、臨床癥狀及實驗室、肝臟影像學檢查均可確診，患者積極配合治療。家屬及患者均知情且簽署知情同意書，經本院醫學倫理委員會審核并通過。排除標準：孕婦及哺乳期婦女，原發性肝癌、肝性昏迷及其他心、肺、腎等重要器官功能衰竭者。另選健康體檢者30例作為對照組，其中男20例，女10例，平均年齡（58.32±6.67）歲。

1.2 實驗室檢測

1.2.1 血清TLR-4濃度測定 采用酶聯免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定患者外周血TLR-4濃度（試劑盒購自寧波美康生物科技股份有限公司），檢測過程按照試劑盒說明書的使用方法。

1.2.2 肝硬化患者腸黏膜損傷相關指標測定 ①血清內毒素濃度：使用動態比濁法（鱟試劑）測定。患者于清晨空腹狀態下抽取外周靜脈血5ml，置入無熱原試管中，離心速度3 500r/min，離心時間12min。②尿乳果糖和甘露醇比值（L/M）測定：采用離子色譜法測定尿乳果糖和甘露醇濃度，并計算L/M。③D-乳酸測定：使用酶學分光光度檢測，空腹狀態下抽取外周靜脈血離心后血漿置于試管中，采用濃度為4.6mmol/L 的NAD+碳酸鹽溶液混合。待測試管中注入50μl D-乳酸脫氫酶，空白管加入50μl 蒸餾水，以空白管調零于340nm 處測定吸光度。

1.2.3 CD3+、CD4+、CD8+T細胞亞群的測定 采用流式細胞儀及配套試劑（美國BD 公司）測定外周血CD3+、CD4+、CD8+淋巴細胞亞群計數。

1.3 統計學方法采用SPSS 20.0 統計學軟件對數據進行處理，計量資料采用±s表示，比較采用多組間單因素方差分析（F檢驗），以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組間血清TLR-4水平、內毒素、D-乳酸及L/M的比較觀察2、3組血清TLR-4濃度顯著高于觀察1組、對照組，組間差異有統計學意義（P<0.05）；觀察3組血清TLR-4濃度顯著高于觀察2組，組間差異有統計學意義（P<0.05）。觀察3組血清內毒素、L/M 與D-乳酸濃度高于對照組及觀察1、2組，組間差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 組間T細胞亞群檢測結果比較觀察1、2、3組外周血CD3+、CD4+、CD8+水平顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表1 各組TLR-4、內毒素、L/M 與D-乳酸的比較（±s）

表1 各組TLR-4、內毒素、L/M 與D-乳酸的比較（±s）

組別 TLR-4（pg/ml）內毒素（EU/ml） L/M D-乳酸（mg/L）觀察1組（n=28） 4.69±0.82 0.45±0.12 0.46±0.13 4.05±0.78觀察2組（n=29）17.85±3.09 0.47±0.09 0.48±0.14 4.19±0.73觀察3組（n=28）38.87±5.96 0.48±0.11 0.49±0.15 4.21±0.69對照組（n=30） 4.53±0.85 0.35±0.08 0.25±0.07 3.10±0.91 F 37.57 46.36 52.15 43.33 P 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 各組T細胞亞群檢測結果的比較（±s，cell/μl）

表2 各組T細胞亞群檢測結果的比較（±s，cell/μl）

組別 CD3+ CD4+ CD8+觀察1組（n=28）903.12±105.01 488.69±54.98 423.69±51.02觀察2組（n=29） 756.15±76.02 410.01±40.79 363.98±32.96觀察3組（n=28）624.70±127.99 336.10±69.13 324.11±48.09對照組（n=30） 965.20±190.55 796.50±110.85 565.12±86.69 F 20.50 20.65 15.98 P 0.000 0.000 0.000

2.3 TLR-4、T淋巴細胞亞群與內毒素、L/M、D-乳酸相關性分析TLR-4 與血清內毒素、L/M、D-乳酸濃度呈正相關（r分別為0.532、0.487、0.512，P<0.05）；外周血淋巴細胞亞群CD3+與血清內毒素、L/M、D-乳酸濃度呈負相關（r分別為-0.492、-0.516、-0.637，P<0.05）；CD4+與血清內毒素、L/M、D-乳酸濃度呈負相關（r分別為-0.531、-0.461、-0.547，P<0.05）；CD8+與血清內毒素、L/M、D-乳酸濃度呈負相關（r分別為-0.476、-0.563、-0.621，P<0.05）。

3 討論

肝硬化是各種慢性肝病逐漸發展到終末階段的一種病理狀態。在肝硬化階段門靜脈高壓引起腸系膜上、下靜脈淤血，胃腸粘膜淤血水腫破壞上皮細胞連接，粘膜屏障功能減退、破壞。研究表明[1，2]，T淋巴細胞和sIgA（漿細胞、肝臟分泌）對維護腸黏膜屏障的完整性有重要作用。在肝硬化進展過程中，肝硬化患者腸粘膜相關淋巴組織及肝枯否氏細胞處理和傳遞抗原、清除細菌及內毒素的免疫功能逐漸減退。肝硬化患者腸粘膜屏障功能受損和宿主免疫功能減退是腸道細菌易位的主要危險因素。細菌內毒素、L/M 及D-乳酸為常用評價腸粘膜屏障受損實驗室檢查指標。TLR-4是Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）亞型，可開啟固有免疫應答，激活NF-κB 信號傳導途徑，釋放炎癥介質（TNF-α、IL-1β、IL-6 等），介導炎癥反應，TLR-4可以用來評價腸粘膜屏障受損程度。

本研究肝硬化患者血清內毒素、L/M、D-乳酸與TLR-4、T細胞亞群變化特點及相關性，觀察3組血清內毒素、L/M 與D-乳酸濃度高于對照組及觀察1、2組，組間差異有統計學意義（P<0.05）。隨著肝硬化病情的進展，患者血清內毒素和其它細菌代謝產物（L/M 與D-乳酸）濃度逐漸上升，表明肝硬化患者腸道內細菌大量繁殖，并進入血液。由此可見，血清內毒素在診斷腸道細菌感染方面具有較高價值。黨燕等[3]研究認為，肝硬化失代償期繼發腹水感染后患者血清內毒素濃度明顯升高，在診斷肝硬化腹水感染方面具有很高的敏感性和特異性。黃芬等[4]研究認為監測血清內毒素濃度可用于判斷肝硬化腸源性感染的療效。

TLR-4 屬于細胞表面TLRs，對人體固有免疫應答有重要調控作用，主要分布在肝臟的肝星狀細胞（HSC）膜上。表達于巨噬細胞和肝枯否氏細胞表面的TLR-4 的功能主要是識別革蘭陰性菌的成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），激發炎癥反應。本研究中，失代償期肝硬化患者（觀察2、3組）血清TLR-4濃度顯著高于代償期肝硬化患者（觀察1組）和對照組，表明失代償期肝硬化患者處于細菌性炎癥反應狀態。據此進一步分析發現，Child-Pugh C級（觀察3組）失代償期的肝硬化患者炎癥反應程度高于Child-Pugh B級（觀察2組）。失代償期肝硬化患者腸粘膜屏障受損程度加重，細菌易位導致的炎癥反應程度逐漸加劇。本研究表明，TLR-4表達與腸道細菌易位的發生密切相關。趙秀娟等[5]研究發現，TLR-4 血清濃度在慢性乙型肝炎和肝硬化患者中均明顯升高，且在失代償期肝硬化患者中濃度最高，本研究結果與上述文獻報道結果相似。此外，陳芳等[6]認為高表達的TLR-4、TGF-β1 可能誘導參與、促進肝膠原纖維的大量合成，抑制膠原纖維降解，導致肝組織纖維化及肝硬化的發生、發展。肝硬化患者腸粘膜屏障損害發生的菌血癥、炎癥反應可能在一定程度上進一步加速肝硬化進程。

在人體內T淋巴細胞執行的是細胞免疫功能，外周血T細胞數量的減少可導致機體細胞免疫功能損害。肝臟具有的免疫功能是機體免疫的組成部分，肝功能失調在人體特異性免疫、非特異性免疫的紊亂中起重要作用。研究認為[7，8]，乙肝后肝硬化患者T淋巴細胞亞群（CD4+、CD8+）的變化，可作為動態指標來反映機體細胞免疫和體液免疫功能，可為乙肝后肝硬化患者的病情判斷、療效及預后的評估提供依據。本研究中，肝硬化患者外周血CD3+、CD4+、CD8+計數顯著低于對照組；觀察1組外周血CD3+、CD4+、CD8+計數值顯著高于觀察2、3組；觀察2組外周血CD3+、CD4+、CD8+顯著高于觀察3組。我們認為，肝硬化患者體內CD3+、CD4+、CD8+數量減少與脾功能亢進有直接關系，脾臟破壞了大量的免疫細胞。有研究發現肝硬化患者免疫功能變化、Child-pugh分級變化與機體受到的炎性應激有關[9～11]。在本研究結果中，TLR-4 與內毒素、L/M、D-乳酸呈正相關；T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+與內毒素、L/M、D-乳酸呈負相關，腸黏膜屏障受損引起的菌血癥、炎癥反應進一步損害機體的免疫功能調節。

肝硬化患者外周血TLR-4濃度變化可以反映其腸黏膜屏障功能受損程度，同時腸黏膜損傷與T細胞CD3+、CD4+、CD8+亞群顯著相關，TLR-4濃度與T細胞CD3+、CD4+、CD8+計數可作為肝硬化患者腸黏膜屏障功能損傷的評價指標。