D3/D5～6胚胎序貫移植對(duì)既往體外受精—胚胎移植失敗患者凍融周期結(jié)局的影響

不孕癥對(duì)患者的身心健康都有不良影響，隨著患者群體的日益增大，現(xiàn)已逐漸成為一個(gè)重要的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問(wèn)題。近年來(lái)，體外受精（IVF）治療周期中獲得優(yōu)質(zhì)胚胎的數(shù)量增多，但臨床妊娠率始終徘徊在40%～70%，胚胎種植率波動(dòng)于25%～35%。如何提高胚胎種植率仍然是體外受精—胚胎移植（IVF-ET）妊娠成功的重要議題。在IVF-ET 中，反復(fù)種植失敗（RIF）的發(fā)生率高達(dá)10%～15%[1]，即行3次新鮮周期或凍融周期移植以上，且累計(jì)移植了4枚以上優(yōu)質(zhì)胚胎后仍未獲得臨床妊娠[2]。RIF 不但加重不孕患者的不良情緒，還增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。相較于針對(duì)性治療RIF，提高胚胎種植率減少RIF 的發(fā)生可能更益于患者的治療。研究顯示，體外培養(yǎng)至囊胚對(duì)胚胎進(jìn)行了進(jìn)一步的評(píng)估和篩選，且更適應(yīng)子宮的生理環(huán)境，有助于改善胚胎種植率[3]。但因體外培養(yǎng)條件的受限，并非所有的胚胎都能發(fā)育至囊胚階段，患者可能無(wú)囊胚可移植。此外，體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)還可引起胚胎表觀遺傳學(xué)的風(fēng)險(xiǎn)，所以目前的證據(jù)顯示囊胚移植的優(yōu)勢(shì)仍有爭(zhēng)議。為改善妊娠結(jié)局，有臨床研究將序貫移植應(yīng)用于RIF患者，結(jié)果顯示妊娠成功率有明顯提高[4]。Goto 等[5]對(duì)首次行IVF 助孕的患者行序貫移植，也取得了良好的臨床效果。本研究對(duì)既往有IVF-ET失敗的患者改變移植策略，選擇在同一個(gè)凍融移植周期內(nèi)先移植1枚卵裂期胚胎，再移植1枚囊胚，通過(guò)比較臨床結(jié)局探討序貫移植能否提高胚胎利用率，預(yù)防RIF 的發(fā)生，改善妊娠結(jié)局。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象與分組回顧性分析2019年7月～2020年8月既往IVF-ET失敗，于我院行FET 的451例（451個(gè)周期）患者臨床資料。按不同移植策略分為A組（序貫移植組，45例）；B組（單囊胚移植組，283例）；C組（雙囊胚移植組，46例）；D組（雙卵裂期胚胎移植組，77例）為對(duì)照組。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①既往IVF-ET失敗≥1個(gè)周期；②本次移植周期子宮內(nèi)膜厚度＞7mm，既往宮腔鏡檢查示無(wú)子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜息肉及宮腔粘連；③本周期所移植胚胎中至少有1個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①年齡≥40歲；②存在子宮異常，如子宮粘膜下肌瘤、子宮畸形、子宮腺肌癥；③夫妻任何一方染色體核型異常；④合并未能控制的、明確影響妊娠的疾病，如甲狀腺功能異常、糖尿病、高血壓及自身免疫性疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 控制性超促排卵方案及胚胎冷凍 本研究納入患者均采用黃體中期長(zhǎng)方案行控制性超促排卵，當(dāng)有1個(gè)卵泡直徑≥18mm 或3個(gè)卵泡直徑≥17mm時(shí)，于當(dāng)晚注射重組人絨毛膜促性腺激素（HCG）250μg（艾澤，默克雪蘭諾公司）。36h后行陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵術(shù)，給予IVF 或卵泡漿內(nèi)單精子注射（ICSI）。D3 根據(jù)患者新鮮周期情況選擇1～2枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎進(jìn)行移植或玻璃化冷凍，剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)，擇優(yōu)質(zhì)囊胚行玻璃化冷凍。優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎標(biāo)準(zhǔn)：卵裂速度正常，卵裂球分裂同步，大小均勻，胞質(zhì)均勻清晰，碎片含量0～5%。D5～6 觀察胚胎發(fā)育情況并根據(jù)Gardner 囊胚評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行分級(jí)。囊胚的形態(tài)學(xué)觀察分為6期。1期：早期囊胚，囊胚腔不到整個(gè)胚胎的1/2；2期：囊胚腔超過(guò)了胚胎體積的1/2；3期：完全擴(kuò)張囊胚，囊胚腔完全占據(jù)整個(gè)胚胎；4期：擴(kuò)張囊胚，囊胚腔體積增大，透明帶逐漸變薄；5期：正在孵出囊胚，滋養(yǎng)外胚層通過(guò)透明帶向外逸出；6期：孵出囊胚，囊胚完全從透明帶逸出。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)級(jí)：A級(jí)，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞大小均勻、融合；B級(jí)，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞大小不勻，部分未融合；C級(jí)，明顯小于正常，數(shù)目極少。滋養(yǎng)細(xì)胞層分級(jí)：A級(jí)，沿囊胚“赤道面”分布的卵裂球超過(guò)10個(gè)，大小均勻，囊胚底面的細(xì)胞全部形態(tài)清晰，多數(shù)可見(jiàn)細(xì)胞核；B級(jí)，沿囊胚“赤道面”分布的卵裂球10個(gè)左右，大小欠均勻，囊胚底面的細(xì)胞部分形態(tài)清晰，部分可見(jiàn)細(xì)胞核；C級(jí)，沿囊胚“赤道面”分布的卵裂球少于10個(gè)，大小不均勻，囊胚底面的細(xì)胞難以辨認(rèn)，與透明帶之間有明顯的碎片。將評(píng)級(jí)在3BB 以上的囊胚行玻璃化冷凍。

1.2.2 凍融胚胎移植（Frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET）的內(nèi)膜準(zhǔn)備及胚胎移植 規(guī)律排卵的患者行自然周期準(zhǔn)備內(nèi)膜：B超監(jiān)測(cè)排卵，于排卵后第3天或外周血孕酮水平升高后第2天移植卵裂期胚胎，排卵后第5 天移植囊胚。不規(guī)律排卵的患者行替代周期準(zhǔn)備內(nèi)膜：月經(jīng)第3天起口服補(bǔ)佳樂(lè)6～8mg/d，待子宮內(nèi)膜≥8mm 時(shí)應(yīng)用黃體酮轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，于內(nèi)膜轉(zhuǎn)化第4天移植卵裂期胚胎，第6天移植囊胚。移植策略：A組，移植1枚D3 卵裂期胚胎+移植1枚D5～6 囊胚；B組，移植1枚D5～6 囊胚；C組，移植2枚D5～6 囊胚；D組為對(duì)照組，移植2枚D3 卵裂期胚胎。

1.3 妊娠結(jié)局判斷胚胎移植術(shù)后12～14d 行血HCG 檢測(cè)，確定是否妊娠。胚胎移植術(shù)后26～28d行陰道B超檢查，確認(rèn)妊娠情況。超聲可見(jiàn)妊娠囊者為臨床妊娠，妊娠時(shí)間超過(guò)12 周者為繼續(xù)妊娠。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較4組患者的年齡、基礎(chǔ)卵泡刺激素（FSH）、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、移植日子宮內(nèi)膜厚度比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

2.2 臨床妊娠結(jié)局比較A組、C組的臨床妊娠率均顯著高于D組（P<0.05），A組與C組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；B組的臨床妊娠率與D組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。B組、C組與D組的繼續(xù)妊娠率相近，A組的繼續(xù)妊娠率顯著高于D組（P<0.05）。A組、B組與C組的胚胎種植率無(wú)明顯差異，但均顯著高于D組（P<0.05）。B組中5例為單卵雙胎妊娠，多胎率為3.33%，顯著低于D組（P<0.05）；C組多胎率高于D組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），A組與D組的多胎率相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

表1 各組患者一般資料比較

表2 各組患者臨床妊娠結(jié)局比較（%）

3 討論

序貫移植策略最早開(kāi)始于1988年，Abramovici等[7]發(fā)現(xiàn)序貫移植可以顯著提高IVF-ET 的妊娠率。但隨后研究者們針對(duì)序貫移植展開(kāi)的多項(xiàng)研究，得出的結(jié)論并不一致。有學(xué)者認(rèn)為第二次移植可能對(duì)子宮內(nèi)膜造成傷害甚至引發(fā)宮腔感染，不利于胚胎的種植，會(huì)降低妊娠率[8]。也有研究認(rèn)為第二次移植對(duì)胚胎植入過(guò)程無(wú)不利影響，且兩次連續(xù)的重復(fù)移植操作對(duì)妊娠率無(wú)顯著影響[9]。近年的研究?jī)A向于將序貫移植應(yīng)用于RIF患者，發(fā)現(xiàn)序貫移植相對(duì)于傳統(tǒng)的卵裂期胚胎移植，可以提高RIF患者的胚胎種植率和臨床妊娠率[4，10，11]，序貫移植因此備受關(guān)注。

國(guó)內(nèi)發(fā)表的關(guān)于序貫移植的研究并不多見(jiàn)，主要應(yīng)用于RIF患者。王俊超等[12]將序貫移植應(yīng)用于RIF患者的解凍周期，發(fā)現(xiàn)序貫移植相對(duì)于單純囊胚移植可顯著提高臨床妊娠率（60.6% vs 31.3%）和胚胎種植率（34.8% vs 23.8%）。通過(guò)對(duì)既往IVF失敗患者新鮮周期的研究，梁怡婳等[13]認(rèn)為序貫移植相較于卵裂期胚胎移植組和囊胚移植組，其胚胎種植率和臨床妊娠率均無(wú)顯著變化（20.5% vs 23.2% vs 28.2%、47.1% vs 49.7% vs 44.6%，P>0.05），且單純囊胚組的臨床妊娠率也無(wú)顯著提高，這一結(jié)果與其他研究并非一致[14]。在Kaur 等[15]的研究中，囊胚移植的胚胎種植率和臨床妊娠率明顯高于卵裂期胚胎移植，分別可達(dá)35.17%和66.00%。考慮新鮮移植周期過(guò)高的雌激素水平可能使得種植窗發(fā)生改變，導(dǎo)致種植窗提前關(guān)閉，從而影響了囊胚種植率，本研究選擇將序貫移植應(yīng)用于胚胎凍融周期并得出了不同結(jié)論。本研究中有囊胚移植的A、B、C 三組的胚胎種植率相近，均顯著高于D組。Phillips 等[16]比較了有囊胚形成與無(wú)囊胚形成患者的妊娠結(jié)局，對(duì)有囊胚形成組行D3/D5～6序貫移植，對(duì)無(wú)囊胚形成組行單純D3 移植，妊娠率有顯著差異（52.7% vs 37.5%，P<0.05），研究者認(rèn)為序貫移植對(duì)妊娠率的提高與囊胚養(yǎng)成密切相關(guān)。Goto 等[5]對(duì)首次行IVF-ET 的患者依據(jù)患者的意愿給予序貫移植或傳統(tǒng)D3 移植，與Phillips等[16]不同，該研究中序貫移植組包括因養(yǎng)囊失敗僅進(jìn)行了一次移植的患者，序貫移植組的妊娠率和胚胎種植率均顯著高于傳統(tǒng)D3 移植組（59.7%vs 30.0%，27.8% vs 11.1%，P<0.05）。研究者推測(cè)，序貫移植妊娠率的提高不能單解釋為與囊胚移植有關(guān)。

目前，序貫移植提高妊娠率的機(jī)制主要有以下幾種解釋：①序貫移植胚胎的兩種培養(yǎng)系統(tǒng)，可能更益于胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)在體外，胚胎與子宮內(nèi)膜共同培養(yǎng)組的胚胎發(fā)育情況和囊胚養(yǎng)成率明顯優(yōu)于胚胎單獨(dú)培養(yǎng)組[17]。②前次移植中移植導(dǎo)管對(duì)子宮內(nèi)膜產(chǎn)生的機(jī)械刺激，可誘發(fā)子宮內(nèi)膜適度炎癥反應(yīng)并誘導(dǎo)內(nèi)膜分泌某些促進(jìn)胚胎種植的細(xì)胞因子，從而有助于提高胚胎種植率[18]。③前次移植的胚胎與子宮內(nèi)膜產(chǎn)生交互作用，有利于胚胎著床。胚胎移植后自分泌的HCG 等蛋白可誘導(dǎo)宮腔內(nèi)膜向易于胚胎種植的狀態(tài)發(fā)育，被誘導(dǎo)的內(nèi)膜借助其免疫細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子可以進(jìn)一步促進(jìn)胚胎的粘附。體外培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，共同培養(yǎng)早期胚胎與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，可誘使子宮內(nèi)膜進(jìn)入種植窗期[19]。Eyheremendy 等[20]認(rèn)為這可能與胚胎分泌的一些生長(zhǎng)因子有關(guān)，如IL-1、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已有研究證實(shí)，胚胎在子宮腔可以改善子宮內(nèi)膜的容受性，提高種植率[21]。④兩次移植有利于增加胚胎與子宮內(nèi)膜“種植窗”同步的機(jī)會(huì)。一般情況下，胚胎于受精后的6～7d種植于子宮內(nèi)膜。約1/3 不孕癥患者的子宮內(nèi)膜種植窗存在改變，表現(xiàn)有種植窗縮短、提前或延后，有研究對(duì)同一患者先后做了3次內(nèi)膜活檢確認(rèn)“種植窗”，結(jié)果每一次的種植窗時(shí)間都不統(tǒng)一，分別是排卵后的第10天、第7天和第9天。可見(jiàn)，同一患者于不同周期種植窗時(shí)間都可能是非固定的[22]。種植窗的改變影響了胚胎與子宮內(nèi)膜的同步化可能是導(dǎo)致部分不孕癥患者IVF 失敗的原因[23]。序貫移植在1個(gè)周期內(nèi)行2次移植，增加了胚胎與子宮內(nèi)膜“種植窗”同步的機(jī)會(huì)，可能更利于提高妊娠率。本研究中發(fā)現(xiàn)D3/D5～6序貫移植組與單純D3組相比，在種植率和臨床妊娠率都顯著提高的同時(shí)，多胎率并沒(méi)有顯著提高，推測(cè)序貫移植中的某一次移植機(jī)會(huì)可能剛好與發(fā)生改變的種植窗相吻合，從而提高了胚胎種植率和臨床妊娠率。但也不能排除可能與前次移植胚胎與內(nèi)膜產(chǎn)生細(xì)胞因子水平的交互作用有關(guān)，因?yàn)樵诒狙芯拷Y(jié)果中我們還發(fā)現(xiàn)序貫移植組的繼續(xù)妊娠率高于其他組并且顯著高于對(duì)照組。這在非RIF患者的序貫移植研究中也有相似結(jié)果，序貫移植組的胚胎種植率、臨床妊娠率以及活產(chǎn)率均高于D3 胚胎移植組，且流產(chǎn)率降低[17]。但在RIF患者序貫移植的相關(guān)研究中卻未有體現(xiàn)，這可能與RIF患者存在某些異常免疫狀態(tài)有關(guān)。

本中心為控制多胎率，凍融移植周期選擇以單囊胚移植為主，序貫移植和雙囊胚移植的樣本量還是相對(duì)較小。從目前的研究結(jié)果分析，D3/D5～6序貫移植可以達(dá)到與雙囊胚移植一樣高的妊娠率，且不增加多胎妊娠率。對(duì)囊胚數(shù)量有限的患者，序貫移植可作為一種有效改善妊娠結(jié)局的移植策略。因胚胎移植后子宮內(nèi)膜狀態(tài)的測(cè)定具有創(chuàng)傷性，序貫移植的作用機(jī)制目前還缺乏臨床數(shù)據(jù)加以佐證。在今后的研究中，仍需加大序貫移植樣本量，綜合評(píng)估患者多方面因素后，并嘗試與免疫指標(biāo)相結(jié)合，對(duì)患者分類、分層檢測(cè)，進(jìn)一步明確序貫的作用機(jī)制，從而精準(zhǔn)目標(biāo)人群，發(fā)揮序貫移植的長(zhǎng)處。