高效液相色譜法測定分析原料藥氟胞嘧啶中有關物質的方法驗證

（精華制藥集團南通有限公司，江蘇南通 226407）

5-氟胞嘧啶（5-Flμcylosine） （簡稱5-FC），化學名為4-氨基-5-氟-2（1H）-嘧啶酮，對隱球菌屬和念珠菌屬等具有較高抗菌活性，對著色真菌、少數曲霉菌屬有一定抗菌活性，其抗菌作用在臨床上得到廣泛應用，其藥用機制是替代尿嘧啶進入DNA 分子中，阻斷核酸合成，也是抗癌原料藥卡培他濱、氟西他濱關鍵中間體[1]。

5-氟胞嘧啶的雜質控制方法在中國藥典中已有摘錄，但應對國外市場，必須符合歐洲以及美國藥典的要求。為此，本實驗室為更好地控制產品質量，在中國藥典的基礎上，結合歐洲及美國藥典的要求，對測試方法進行了專題研究和一定程度的優化。

1 探討與分析

1.1 檢測方法的選擇

美國藥典采用薄層色譜法（TLC）檢測5-氟胞嘧啶的有關物質，中國藥典和歐洲藥典都采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography HPLC）檢測5-氟胞嘧啶的有關物質。高效液相色譜法用作定量分析時，較薄層色譜法更為準確，且精確度和靈敏度高。因此，選擇HPLC 測定5-氟胞嘧啶的有關物質。

1.2 流動相的選擇

為選取最優的流動相體系，分別考察了中國藥典方法流動相A（甲醇-水）、歐洲藥典方法流動相B（甲醇-磷酸二氫鉀水溶液）、流動相C（甲醇-磷酸二氫鈉水溶液）3 種流動相體系，在同一濃度下進行峰面積比較。結果表明，當選取流動相C 時，其靈敏度和峰形達到最佳，相鄰峰之間的分離度較好，因此最終選擇流動相C 作為最優流動相體系。

1.3 檢測波長的確定

為選取最合適的檢測波長，用加有雜質的氟胞嘧啶溶液在200 ～ 380 nm 進行波長掃描。測試結果表明，在260 nm 處，氟胞嘧啶和其雜質均有較大吸收，故選擇260 nm 作為檢測波長。

2 改進后的方法學驗證

2.1 驗證參數

專屬性、重復性、中間精密度、準確度、檢出限、定量限、線性范圍、耐用性[2-5]。

2.2 儀器與試劑

島津LC-20AT 高效液相色譜儀及Labsolution CS工作站、色譜柱C18（4.6×250 mm×5μm）、氟胞嘧啶標準品（R03100）、氟尿嘧啶標準品（R009T0）、氟胞嘧啶原料藥（自制）等。甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

2.3 色譜條件

流動相：稱取2.72 g 磷酸二氫鈉溶于1 800 mL純化水中，用磷酸調節pH 至3.0，然后加入一定量的甲醇，使溶液的甲醇濃度為5%，用0.45μm 過濾膜過濾，脫氣即得。流速0.8 mL/min，檢測波長260 nm，進樣量20 μL，柱溫25 ℃。

進樣次序：第一針進空白，接著進系統適應性試液、氟尿嘧啶對照液、標準溶液稀釋液各一針，然后進五針標準液（第一份），再進一針標準液（第二份），再進兩針平行樣品，最后再進一針標準液（第一份）。連續進樣品的針數不得超過十針，超過十針需每十針間隔進一針標準液（第一份）。標準液（第二份）用于計算回收率。

系統適應性要求：重復進6 針標準溶液，在所得的色譜圖中，要求6 針標準溶液氟胞嘧啶峰面積的RSD ≤2.0%，系統適應性溶液中氟胞嘧啶與氟尿嘧啶的分離度R≥2。按照外標法以峰面積進行計算，即得含量。

2.4 樣品與對照制備

2.4.1 標準對照溶液配置

標準溶液：準確稱取10 mg 氟胞嘧啶標準品于100 mL 容量瓶中，加入80 mL 水，用超聲波完全溶解后定容。

標準溶液稀釋液：精密吸取1 mL 標準溶液用超純水稀釋至100 mL，再吸取1 mL 前溶液用超純水稀釋至10 mL。

氟尿嘧啶對照液：精密稱取取氟尿嘧啶標準品10 mg，加超純水使溶解成200 mL，準確吸取該溶液1.0 mL 稀釋至100 mL，再準確吸取稀釋液 1.0 mL 稀釋至 10 mL，即得。

加雜測試液：準確稱取10 mg 樣品于100 mL 容量瓶中，加入100 μL 氟尿嘧啶對照液中配制過程中的0.05 mg/mL 的高濃度溶液，加適量的水超聲溶解后定容。

2.4.2 樣品測試溶液

準確稱取10 mg 樣品于100 mL 容量瓶中，加入80 mL 水，用超聲波完全溶解后定容，即得。

3 實驗結果

3.1 專屬性

將氟尿嘧啶對照液、標準溶液稀釋液、系統適應性溶液、標準溶液、樣品測試溶液、加雜測試液，分別進樣。檢測結果見表1。

表1 專屬性的檢測結果Tab.1 Test results of specificity

對比所測試的每張色譜圖，樣品、雜質、對照的出峰時間沒有重疊或交叉，且峰型近似于對稱形正態分布曲線，不拖尾，不前伸。樣品溶液中氟胞嘧啶與相鄰雜質峰分離度為10.01，系統適應性溶液中氟胞嘧啶與氟尿嘧啶的分離度為10.13。測試結果表明空白溶劑不干擾本品的有關物質的檢查，樣品對雜質出峰無干擾，各峰之間能有效分離，該方法專屬性強。

3.2 重復性

分別配制6 份標準溶液，每份各進樣1 針，六次測定的氟胞嘧啶峰面積RSD 為0.02%。

分別配制6 份加雜測試溶液，每份溶液進樣1針，用氟尿嘧啶對照液中氟尿嘧啶的峰面積計算雜質的回收率，六次測定主峰氟胞嘧啶平均回收率為101.03%，回收率的相對標準偏差RSD 為0.01%；雜質氟尿嘧啶平均回收率為100.66%；回收率的相對標準偏差RSD 為0.31%。從該項測試的RSD 結果可知，該方法具有良好的重復性。

3.3 中間精密度

由不同的分析員在不同的時間用另外一臺儀器，按照重復性項的方法進行測試。兩組12 次測定結果，雜質氟尿嘧啶平均回收率為102.12%，回收率相對標準偏差RSD 為1.66%；氟胞嘧啶平均回收率為101.50%，回收率相對標準偏差RSD 為0.48%；證實該方法中間精密度良好。

3.4 檢出限

在選定的色譜條件下，以信噪比（S/N）約為3時相應的試樣濃度來確定，雜質氟尿嘧啶的檢出限為0.003 5 μg/mL，氟胞嘧啶的檢出限為0.007 0 μg/mL。

3.5 定量限

把已知濃度樣品溶液稀釋到低濃度的試樣，測出的信號與空白處的信號（基線噪音）進行比較，算出能被可靠檢測出的最低濃度或百分比。以信噪比（S/N）約為10 時相應的試樣濃度來確定，雜質氟尿嘧啶定量限為0.01 μg/mL，氟胞嘧啶定量限為0.02 μg/ mL。

3.6 線性及范圍

在LOQ 濃度至不低于120%指標濃度的范圍內取6 個濃度點進行研究。線性關系以測得的響應信號（峰面積）對被分析物濃度的函數作圖，用最小二乘法進行線性回歸，要求線性相關系數r≥0.996。測得雜質氟尿嘧啶線性回歸方程y= 84 059x+ 13.206，相關系數r= 0.999 9（見圖1）；測得氟胞嘧啶線性回歸方程y= 48 522x+ 17.194，相關系數r= 0.999 8（見圖2）。測試結果表明，雜質氟尿嘧啶質量濃度在0.01 ～ 0.06 μg/mL 范圍內，氟胞嘧啶質量濃度在0.02 ～ 0.12 μg/mL 范圍內，具有良好的線性關系。

3.7 準確度

準確度測定：加入濃度為樣品配置濃度，檢出濃度為樣品通過液相色譜檢測出峰面積然后換算成濃度，回收率=檢出濃度/加樣濃度×100%。

在不含氟胞嘧啶的空白溶劑（超純水）中，加入氟胞嘧啶標準品，配置成標準溶液濃度的80%、100%、120% 三種溶液，分別進樣。測得雜質氟尿嘧啶回收率在99.65%～100.08%，定量限處回收率在99.30%～100.30%，氟胞嘧啶回收率在97.75%～97.91%，定量限處回收率在97.84%～97.87%，符合驗證要求。

圖1 雜質氟尿嘧啶線性關系圖Fig.1 Linear relationship of impurity fluorouracil

圖2 氟胞嘧啶線性關系圖Fig.2 Linear relationship of fluorocytosine

測試結果表明，此方法測得的結果與真實值之間較為接近，且在同一水平濃度上有較高的精確度，該測試方法準確度高。檢測結果見表2、表3。

3.8 耐用性的測定

3.8.1 溶液的穩定性

通過配制標準溶液、樣品測試溶液、加雜測試溶液，在自然常溫環境下，將容量瓶中的溶液放置0 h、8 h、12 h、24 h 和48 h 后進行測試，計算峰面積RSD。測試結果（見表4），供試品溶液在自然常溫條件下放置48 h 內穩定性良好。

3.8.2 流速的影響

配制加雜測試溶液，在不改變其他色譜條件的前提下，分別設定流動相流速為0.7 mL/min、0.8 mL/ min、0.9 mL/min，評估測定條件參數微小變動時，主峰氟胞嘧啶和雜質氟尿嘧啶峰面積的回收率。測試結果（見表5）表明，三種流速下對樣品的測試結果影響不大。

表2 雜質氟尿嘧啶準確度的測試結果Tab.2 Test results of accuracy of impurity fluorouracil

表3 氟胞嘧啶準確度的測試結果Tab.3 Test results of accuracy of fluorocytosine

表4 溶液的穩定性測試結果Tab.4 Stability test results of solution

3.8.3 柱溫的影響

配制加雜測試溶液，在不改變其他色譜條件的前提下，分別設定色譜柱溫度為23 ℃；25 ℃；27 ℃分析，評估測定條件參數微小變動時，主峰氟胞嘧啶和雜質氟尿嘧啶峰面積的回收率。測試結果（見表6）表明，柱溫在23 ～ 27 ℃范圍內，對樣品的測試結果影響不大。

表5 流速對測試結果的影響Tab.5 Effect of flow rate on test results

表6 柱溫對測試結果的影響Tab.6 Effect of column temperature on test results

3.8.4 色譜柱的影響

配制加雜測試溶液，在不改變其他色譜條件的前提下，分別采用同一生產商兩個不同批號的色譜柱分析，評估測定條件參數微小變動時，主峰氟胞嘧啶和雜質氟尿嘧啶峰面積的回收率。測試結果（見表7）表明，同一生產商不同批號的色譜柱對樣品的測試結果影響不大。

表7 色譜柱對測試結果的影響Tab.7 Influence of chromatographic column on test results

3.8.5 流動相pH 值的影響

配制加雜測試溶液，在不改變其他色譜條件的前提下，調節流動相的pH 值分別為2.8、3.0、3.2，評估測定條件參數微小變動時，主峰氟胞嘧啶和雜質氟尿嘧啶峰面積的回收率。測試結果（見表8）表明，流動相pH 值在2.8 ～ 3.2 范圍內，對樣品的測試結果影響不大。

表8 流動相pH 值對測試結果的影響Tab.8 Influence of pH value of mobile phase on test results

3.9 樣品測試

分別稱取FLC2020001、FLC2020002、FLC2020003 三個批號的樣品進行測試，結果顯示該三批樣品中雜質氟尿嘧啶和未知雜質均未檢出。

4 結論

本文對現有5-氟胞嘧啶中有關物質的質量控制方法進行了研究與探討，建立了更為嚴格、準確的檢測方法，即在本實驗室確立的條件下，采用高效液相色譜法測定氟胞嘧啶中的有關物質，并對線性試驗、精密度試驗、準確度試驗、耐用性試驗進行方法驗證。

測試結果表明空白溶劑不干擾本品的有關物質的檢查，樣品對雜質出峰無干擾，樣品溶液中氟胞嘧啶與相鄰雜質峰分離度為10.01，專屬性強。重復性項下的測試結果RSD 為0.02%。中間精密度項下，雜質氟尿嘧啶平均回收率為102.12%，RSD 為1.66%；氟胞嘧啶平均回收率為101.50%，RSD 為0.48%。雜質氟尿嘧啶的檢出限為0.003 5 μg/mL，氟胞嘧啶的檢出限為0.007 0 μg/mL。雜質氟尿嘧啶定量限為0.01 μg/mL，氟胞嘧啶定量限為0.02 μg/mL。雜質氟尿嘧啶質量濃度在0.01 ～ 0.06 μg/mL，氟胞嘧啶質量濃度在0.02 ～ 0.12 μg/mL，具有良好的線性關系。耐用性測試結果表明，樣品溶液在自然常溫條件下放置48 h 內穩定性良好；流動相流速為（0.8 ± 0.1） mL/ min、色譜柱溫度為（25 ± 2） ℃、流動相pH 值為2.8 ～ 3.2，對樣品的測試結果影響不大。表明該控制方法重復性好，專屬性強，檢測結果準確、可控，可以有效控制該產品的質量。