HSP60和TK1在宮頸癌中的表達

曾 琛 楊光華 向 森 趙富麗

宮頸癌是我國女性最常見的生殖系統惡性腫瘤之一，50%生殖系統惡性腫瘤均為宮頸癌，且發病呈年輕化趨勢，對女性生殖健康造成嚴重威脅。宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)是一組子宮頸病變，與宮頸癌發生發展過程密切相關。宮頸癌早期診斷、及時治療是改善患者預后的關鍵。有研究顯示，經手術治療的早期宮頸癌患者，5年生存率高達90%。早期診斷宮頸癌的腫瘤標志物是當前相關領域研究熱點。熱休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)具有多種生理功能，可使細胞蛋白維持穩定，有利于細胞生存，HSP60與惡性腫瘤細胞增殖、分化、侵襲等惡性生物學行為有關，過度表達可能與子宮頸癌侵襲前病變相關。胸苷激酶1(thymidine kinase 1，TK1)存在于細胞質中，是參與DNA合成的關鍵酶，在腫瘤治療監測方面具有重要作用，但HSP60、TK1與宮頸癌的關系尚有待研究。本研究通過檢測正常宮頸組織、CIN組織、宮頸癌組織中HSP60、TK1的表達情況，分析其與宮頸癌病理特征關系，探討HSP60、TK1在宮頸癌發生發展中的作用及意義，為宮頸癌臨床診斷提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年5月至2014年5月駐馬店市中心醫院收治的宮頸癌患者42例(宮頸癌組)、CIN患者40例(CIN組)、正常宮頸健康體檢者40例(正常宮頸組)為研究對象。宮頸癌組患者，年齡41～73歲，平均(55.27±6.54)歲;鱗癌24例;腺癌18例;根據國際婦產科聯盟(International Federation of Gynecology and Obstentrics，FIGO)分期標準，包括Ⅰ期17例，Ⅱ期25例。CIN組患者，年齡42～71歲，平均(54.87±6.13)歲。正常宮頸組對象，年齡40～74歲，平均(55.02±6.61)歲。3組研究對象一般資料比較,差異無統計學意義(

P

>0.05)，見表1。

表1 3組研究對象一般資料比較

納入標準：①宮頸癌標本來源于行根治性手術的患者，CIN標本和正常宮頸組織標本來源于行子宮手術的患者，且均經病理檢查證實；②術前未接受放化療；③組織標本獲取及使用均獲得本院倫理委員會批準同意。排除標準：合并其他惡性腫瘤者。

1.2 免疫組織化學方法 采用免疫組織化學SP法(試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司)檢測HSP60、TK1蛋白表達情況。采用10%福爾馬林固定標本，石蠟包埋后進行連續切片，厚度約4 μm，經二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、0.3% 過氧化氫滅活后，抗原修復10 min。一抗4℃孵育12 h，洗滌3～4次后，生物素化標記的鼠抗人HSP60單克隆抗體(購自艾美捷科技有限公司)、鼠抗人TK1單克隆抗體(購自上海群己生物科技有限公司)二抗在室溫下孵育1 h，洗滌3～4次，加入辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素孵育0.5 h，然后DAB染色(DAB顯色試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司)。在顯微鏡下觀察切片并拍照，HSP60、TK1蛋白表達量采用光密度表示，光密度采用計算機圖像分析系統進行測定。

1.3 分析指標 ①比較3組受試對象的HSP60和TK1蛋白表達情況。②分析不同臨床病理特征間HSP60和TK1蛋白的表達差異。③隨訪1～72個月，以宮頸癌HSP60蛋白光密度值中位水平3.48為分界點，分為2個亞組(HSP60光密度值≤3.48組、HSP60光密度值>3.48組)，以宮頸癌TK1蛋白表達中位水平3.60為分界點，分為2個亞組(TK1光密度值≤3.60組、TK1光密度值>3.60組)，記錄不同亞組的5年生存率，分析HSP60和TK1蛋白表達對宮頸癌預后的影響。④隨訪1～72個月，按照是否復發分為復發組與未復發組，分析影響宮頸癌預后的單因素與多因素。⑤采用Pearson相關性分析探討宮頸癌HSP60與TK1表達水平的相關性。

2 結果

2.1 3組研究對象HSP60和TK1蛋白表達情況比較宮頸癌組HSP60和TK1蛋白表達水平均高于CIN組、正常宮頸組(

P

<0.05)，見表2。HSP60和TK1均主要表達于胞質，胞質呈淡黃色到棕黃色等不同染色程度，見圖1。

圖1 免疫組織化學檢測HSP60和TK1蛋白表達情況(SP法)

表2 3組研究對象HSP60和TK1蛋白表達水平光密度值)

2.2 HSP60和TK1蛋白在宮頸癌不同臨床病理特征中的表達情況 不同宮頸癌分化程度、FIGO分期、浸潤深度以及淋巴結轉移與否，HSP60蛋白表達差異有統計學意義(

P

<0.05)；不同年齡、腫瘤直徑及病理類型間表達差異無統計學意義(

P

>0.05)。不同宮頸癌腫瘤直徑、分化程度、FIGO分期、浸潤深度以及淋巴結轉移與否，TK1蛋白表達差異有統計學意義(

P

<0.05)；不同年齡、病理類型間表達差異無統計學意義(

P

>0.05)。見表3。

表3 HSP60和TK1蛋白在宮頸癌不同臨床病理特征中的表達情況光密度值)

2.3 不同HSP60和TK1蛋白表達水平對宮頸癌生存期的影響 所有患者隨訪1～72個月，HSP60光密度值≤3.48組5年生存率為85.71%，HSP60光密度值>3.48組5年生存率為61.90%，兩組生存曲線比較，差異有統計學意義(

P

<0.05)。TK1光密度值≤3.60組5年生存率為90.48%，TK1光密度值>3.60組5年生存率為57.14%，兩組生存曲線比較，差異有統計學意義(

P

<0.05)。見圖2。

圖2 不同HSP60和TK1蛋白表達水平對宮頸癌生存期的影響

2.4 不同臨床病例特征間宮頸癌復發情況的差異 隨訪1～72個月，發現42例宮頸癌患者中腫瘤復發導致死亡10例，遠處或局部轉移給予再次放化療治療10例，無復發22例，按照是否復發分為復發組與未復發組，兩組患者在年齡、腫瘤直徑、病理類型、分化程度、FIGO分期方面差異均無統計學意義(

P

>0.05)，但在浸潤深度、淋巴結轉移、HSP60、TK1蛋白表達方面比較差異有統計學意義(

P

<0.05)。見表4。

表4 不同臨床病例特征間宮頸癌復發情況的差異(例)

2.5 影響宮頸癌預后的多因素分析 經COX分析發現，浸潤深度>1/2間質、淋巴結轉移、HSP60光密度值>3.48、TK1光密度值>3.60是影響宮頸癌預后的獨立危險因素(

P

<0.05)。見表5、6。

表5 分析因素賦值表

2.6 宮頸癌組HSP60與TK1表達水平的相關性分析 經Pearson相關性分析，宮頸癌組織HSP60與TK1表達水平無相關性(

r

=0.058,

P

=0.713)。見圖3。

表6 影響宮頸癌預后的COX分析

圖3 宮頸癌HSP60與TK1表達水平的相關性分析

3 討論

絕大多數宮頸癌的發生與高危型人類乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染有關，其發生過程緩慢，從正常宮頸組織高危型HPV感染到宮頸上皮內病變，再發展為宮頸癌的時間一般需要數年。由于宮頸癌具有發病隱匿，發展速度慢等特點，在宮頸癌前病變階段尋找到能早期篩查、評估患者病情的標志物，對患者病情控制及預后改善意義重大。

熱休克蛋白(heatshock proteins，HSPs)是高度保守的蛋白質，在原核生物及真核生物中廣泛存在。近些年來，有研究發現，HSPs除了維持細胞正常活動，在惡性腫瘤發生發展過程中也起到關鍵作用。HSP60作為HSPs家族重要成員，在前列腺癌和肺癌組織中表達水平明顯升高，可作為標志物。本研究對宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織HSP60進行檢測，結果顯示，宮頸癌組織HSP60表達水平明顯高于CIN組織、正常宮頸組織，且HSP60在不同宮頸癌分化程度、FIGO分期、浸潤深度、淋巴結轉移與否間中表達水平存在差異，提示HSP60可能參與宮頸癌發生發展。分析原因，可能是宮頸癌發生發展過程中引起蛋白異常堆積及局部細胞缺血缺氧，所以HSP60大量合成釋放，而高表達的HSP60又會增強癌細胞逃逸凋亡、抗應激能力，從而促進癌細胞異常增殖。另有研究顯示，HSP60能作用于癌細胞膜上整合素，使之活性升高，從而提高癌細胞侵襲轉移能力，促進惡性腫瘤進展。在預后方面，HSP60光密度值>3.48者5年生存率明顯低于HSP60光密度值≤3.48者；COX分析發現，HSP60光密度值>3.48是影響宮頸癌患者預后的獨立危險因素，提示HSP60對于宮頸癌預后評估具有一定價值。

TK1是DNA合成的關鍵酶之一，惡性腫瘤患者外周血TK1水平不同程度升高。本研究結果顯示，宮頸癌組織中TK1表達量顯著高于CIN組和正常宮頸組，不同腫瘤直徑、分化程度、FIGO分期、浸潤深度、淋巴結轉移與否間表達情況存在差異，提示TK1可能參與宮頸癌發生發展。分析原因，TK1可催化脫氧胸苷轉化為脫氧-1-磷酸胸苷酸，保證DNA順利合成。TK1水平由細胞增殖度決定，在細胞周期G1期過渡到S期時開始升高，并持續至M早期，可反映細胞增殖活性。有研究顯示，惡性腫瘤患者病情程度越嚴重，血液中TK1水平越高，是腫瘤治療監測的可靠標志物。既往一般通過檢測血清TK1水平評估腫瘤患者預后，但血清TK1水平易受血清蛋白、細胞分解等影響，存在局限性。本研究結果發現，免疫組織化學檢測宮頸癌組織TK1表達量與5年生存期有關，TK1光密度值>3.60者5年生存率明顯低于TK1光密度值≤3.60者，COX分析發現TK1光密度值>3.60是影響宮頸癌患者預后的獨立危險因素，提示TK1對于宮頸癌預后評估具有一定價值。經Pearson相關性分析，宮頸癌HSP60與TK1表達水平無明顯相關性，提示HSP60和TK1均可用于評估宮頸癌患者預后，但無明顯相關性。

綜上所述，宮頸癌組織中HSP60、TK1蛋白表達均上調，且兩者水平的升高還可能影響宮頸癌不良預后。