燕山地區板栗果實香氣成分的GC-MS 分析

李 杰，王 雨，劉詩源，高 倩，韓繼成

（河北省農林科學院昌黎果樹研究所，河北 昌黎 066600）

板栗（Castanea mollissima Blume.）為山毛櫸科栗屬植物，原產于我國，是我國特有的優良經濟林樹種之一[1]。板栗植株耐瘠薄，抗寒性和抗旱性較強，適合在我國北方燕山板栗栽培區的山地、丘陵栽培，是山區農民脫貧致富的主要產業和提高農民收入的主要經濟來源。板栗果實不僅營養豐富，還可養胃健脾、補腎強筋[2]。燕山地區板栗果實呈橢圓形，果皮褐色，果面明亮，果肉淡黃色，肉質細糯，風味香甜，澀皮易剝離，適于炒食，是糖炒板栗的主要品種來源。

香氣成分是構成和影響板栗果實鮮食及加工產品的重要因素之一[3-5]，是當前研究的熱點之一。但與蘋果[6-8]、梨[9-11]、葡萄[12-13]、桃[14-15]等果實的香氣研究相比，國內外關于板栗香氣的研究報道還是較少。梁建蘭等[3]采用溶液萃取法對“燕龍”板栗的香氣成分進行了研究；Krist 等[5]使用非極性柱RTx-5 結合溶液萃取法檢測到烤意大利板栗中香氣物質，因其萃取時使用有機溶劑且分析樣品量大、操作過程復雜，在測定過程中很有可能造成部分香氣組分的損失；Künsch等[16]、Morini 等[17]、葉興乾等[18]相繼測定不同品種及不同加工方式中板栗的香氣成分，但并未對萃取頭及色譜柱的選用進行篩選，局限了香氣種類的測定。固相微萃取方法（Solid Phace Microextraction, SPME）具有不需有機溶劑，分析樣品量少，操作簡單、快速、費用低，集采樣、萃取、濃縮及進樣于一體等優點，能有效避免香氣組分的損失[19]。為更好地了解燕山地區特有板栗品種的香氣成分及組成，本試驗采用固相微萃取-氣相色譜-質譜（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）聯用技術，通過比較在使用強極性色譜柱 HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）條件下7 種不同萃取頭萃取香氣成分的差異，篩選出一種適合萃取板栗香氣的最佳效果的萃取頭，對“大板紅”、“冀栗 1 號”及“燕山早豐”3 個板栗品種的果實香氣成分進行測定分析和比較，以期為板栗果實品質鑒定及其香氣物質的遺傳分析提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

以河北省農林科學院昌黎果樹研究所孔莊基地13 年生的“大板紅”、“冀栗 1 號”及“燕山早豐”為試材，基地土壤肥沃，采用常規管理，樹體生長良好。

D-葡萄糖酸內酯、交聯聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVPP）、4-甲基-2-戊醇(4M2P)、C7-C20正構烷烴。

1.1.2 儀器與設備

GCMS-QP2010 型氣相色譜質譜聯用儀，日本SHIMADZU 公司；HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）極性色譜柱，美國Agilent 技術有限公司；ME303E/02 型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Heraeus Megafuge 8R 型高速離心機，熱電實驗設備有限公司奧斯特羅德分公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及處理

果實于成熟期采收。于樹冠外圍中部隨機摘取20 個果實，每個品種3 株。之后每品種隨機選取30個果實，果實去皮后稱取約50 g 用液氮冷凍，加入0.5 g D-葡萄糖酸內酯和1 g PVPP，迅速破碎成粉末狀，置于-80 ℃冰箱中保存，用于香氣物質的測定。

樣品取出后，迅速解凍，4 ℃條件下于8 000 r/min離心10 min，吸取上清液4 mL 置于樣品瓶中，加入10 μL 內標4-甲基-2-戊醇水溶液（1.038 8 g/L）后，迅速用帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子擰緊，靜置20 min，使揮發性成分在液體中、頂空和萃取頭三相中分布達到平衡，然后將老化過的萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，在磁力加熱攪拌器上于40 ℃萃取30 min，取下萃取頭，立即在GC 進樣口250 ℃條件下解析5 min。每個樣品重復萃取進樣3 次。

1.2.2 萃取頭篩選

選擇7 種萃取頭對板栗果實香氣成分進行萃取，比較萃取到的香氣種類，以期選擇1 個最佳萃取效果的萃取頭。各萃取頭在使用前根據使用說明對萃取頭在一定的溫度下進行一定時間的老化。各萃取頭特點見表1。

1.2.3 氣相色譜-質譜條件分析

氣相色譜-質譜聯用儀型號為GCMS-QP2010。氣相色譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣He 氣（純度 99.999%）；柱流量 1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；色譜柱升溫程序為：初始溫度50 ℃，保持 3 min，以 3.5 ℃/min 升至 120 ℃，保持3 min，再以 13 ℃/min 升至 250 ℃，保持 3 min；進樣：不分流進樣。質譜條件：電離方式EI，電子能量70 eV，質量掃描范圍：30～500 amu，離子源溫度 230 ℃，接口溫度250 ℃。

1.2.4 香氣成分定性定量分析

定性方法：依據保留指數法進行定性分析。正構烷烴在同樣的氣相色譜-質譜條件下進樣，獲得正構烷烴內各組分的保留時間，利用自動質譜圖解卷積和鑒定系統（Automatic Mass Spectral Deconvolution andIdentification System，AMDIS）建立保留指數校正庫，利用保留指數及NIST11 譜庫，比對在同樣極性色譜柱條件下測得的香氣成分保留指數結果進行定性，將定性結果依靠可信度強弱分類并詳細記錄，確定各化學成分。

表1 不同萃取頭涂層的使用調節指南Table 1 Conditioning guidelines of different SPME fiber coatings

定量方法：采用峰面積歸一法進行各香氣組分的定量分析。

2 結果與分析

2.1 萃取頭的選擇

由于各種萃取頭的涂層材料及涂層厚度不同，導致萃取頭的極性不同，所以各萃取頭對不同揮發性物質的吸附能力也是不同的。根據“相似相溶”的原則，PDMS 為非極性萃取頭，其主要吸附為非極性物質；PDMS/DVB 萃取頭為極性萃取頭，主要吸收極性揮發性醇類、胺類物質；PA 萃取頭和DVB/CAR/PDMS 萃取頭為極性萃取頭，其中PA 的極性要弱于DVB/CAR/PDMS。運用GC-MS-計算機聯用檢測技術，得到7 種不同萃取頭萃取到的板栗果實香氣成分總離子圖（圖1）。由圖1 可見，7 種萃取頭均能檢測到板栗果實的部分香氣成分，并且50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭檢測到的香氣成分中包括了其他6 種萃取頭所能檢測出的揮發性物質。總之，通過比較7 種不同萃取頭對板栗果實香氣成分萃取效果發現，50/30 μm DVB/CAR/PDMS 的萃取效果明顯好于其他6 種萃取頭。因此，后續板栗果實香氣成分研究工作中將采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭。

圖1 7 種萃取頭得到的板栗果實香氣成分的GC-MS 總離子流圖Fig.1 Total ionic chromatograms of aroma components with 7 different fiber coatings

2.2 板栗果實香氣成分的測定分析

采用 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭提取板栗品種“大板紅”、“冀栗1 號”及“燕山早豐”果實香氣成分，各組分質譜經與計算機譜庫NIST11 和Wiley檢索及保留指數分析，確認其香氣成分，運用峰面積歸一化法，求得各香氣成分的相對含量（表2）。由表2可見，從3 個板栗品種的果實中共檢測到62 種香氣成分，“大板紅”、“冀栗 1 號”及“燕山早豐”分別檢測到33、38 和34 種；各品種的主要香氣成分差異較大，且相對百分含量排在各品種板栗前10 位的芳香成分依次分別為己醛、3-戊烯-2-酮、乙酸己酯、庚醛、1-己醇、1-丁醇、2,3-丁二酮、乙酸丁酯、2-己烯醛、2-己醇；乙醛、3-戊烯-2-酮、庚醛、1-己醇、1-丁醇、反-2-辛烯醛、2-丁烯醛、1-庚醇、1-辛烯-3-醇、2-戊酮；己醛、3-戊烯-2-酮、庚醛、1-己醇、1-丁醇、1-庚醇、2,3-丁二酮、2-丁烯醛、2-戊酮、乙醛。3-戊烯-2-酮、庚醛和1-己醇在3 個品種中均具有較高的相對含量，含量在8%～13%，為板栗的主要香氣成分。

表2 燕山地區板栗品種香氣成分的GC-MS 分析Table 2 GC-MS analysis of aroma components in chestnuts cultivars in Yanshan region

續表2 燕山地區板栗品種香氣成分的GC-MS 分析Continue table 2 GC-MS analysis of aroma components in chestnuts cultivars in Yanshan region

2.2.1 醛類成分的差異

由表2 可見，醛類化合物是測定板栗果實香氣成分中相對含量最高的一類化合物，共檢測到11 種醛類化合物，“大板紅”、“冀栗 1 號”及“燕山早豐”3 個品種板栗分別為4 種、5 種、11 種，其相對含量分別為40.96%、38.78%和50.38%；檢測到共有醛類化合物有2 種，一種為庚醛，以“燕山早豐”的相對含量最高，達9.07%，分別是“大板紅”、“冀栗1 號”含量的1.13、1.10 倍；另一種為反-2-辛烯醛，以“冀栗1 號”的相對含量最高，達4.25%，分別是“大板紅”、“燕山早豐”含量的7.59、3.24 倍。板栗品種間成分差異較大，如“大板紅”和“燕山早豐”以C6 醛類中的己醛為主，相對含量最高，分別為30.24%、35.41%；而“冀栗1 號”中以乙醛為主，含量高達22.20%；同時，還分別從3 個品種中檢測到含量較低的反-2-辛烯醛、丁醛、2-丁烯醛等成分。

2.2.2 醇類成分的分析

由表2 可見，“大板紅”、“冀栗1 號”及“燕山早豐”3 個品種板栗香氣成分中檢測到19 種醇類，分別為13 種、13 種和12 種；而總醇的相對含量在20%左右，3 個品種分別為18.24%、23.67%、18.95%。醇類成分多為1-丁醇和C6 醇類（1-己醇），以“冀栗 1 號”果實中1-丁醇的相對含量最高，達4.96%，“大板紅”次之，“燕山早豐”最低（3.12%）；“燕山早豐”果實中 C6醇類（1-己醇）含量最高，為8.01%，“燕山早豐”次之，“大板紅”最低，僅為7.09%。

此外，從果實中檢測了到少量的3-甲基-1-丁醇、反-2-己烯-1-醇，1-戊醇、1-辛烯-3-醇等成分。

2.2.3 酮類成分的分析

由表 2 可見，“大板紅”、“冀栗 1 號”及“燕山早豐”3 個品種板栗香氣成分中檢測到11 種酮類，分別為4 種、8 種和5 種；而總酮的相對含量在20%左右，3 個品種分別為 15.91%、19.10%、17.11%。3 個品種板栗果實香氣成分中均以3-戊烯-2-酮相對含量最高，分別為11.76%、11.81%、12.56%。同時，還分別從3 個品種中檢測到含量較低的四氫-6-甲基-2H-吡喃-2-酮、3-羥基-2-丁酮、2-羥基3-戊酮等成分。

2.2.4 酯類和其他成分分析

3 個品種板栗果實中共檢測到2 種酯類成分，為乙酸丁酯和乙酸己酯。其中只有在“大板紅”中檢測到這兩種物質，相對含量分別為2.25%、11.58%，而其他兩個板栗品種中均未檢測到酯類物質。

其他香氣成分相對含量在1%以下，包括10 種烷烴、4 種呋喃、2 種胺、2 種酸和 1 種醚類。

2.3 香氣成分的類別比較

由表3 可以看出，在檢測到的9 類化合物中，參試的3 個板栗品種相對含量差異明顯。同一品種板栗不同種類化合物之間相對含量不同，“大板紅”以醛類、醇類、酮類和酯類為主，而“冀栗1 號”和“燕山早豐”以醛類、醇類和酮類為主；在同類化合物中，不同品種板栗的相對含量存在明顯差異，其中醛類以“燕山早豐”相對含量最高（50.38%），分別是“大板紅”與“冀栗 1 號”的 1.23、1.30 倍；醇類以“冀栗 1 號”最高（23.67%），分別是“大板紅”與“燕山早豐”的1.30、1.25 倍；而酮類以“冀栗1 號”相對含量最高（19.10%），分別是“大板紅”與“燕山早豐”的1.20、1.12 倍。

表3 不同板栗品種果實香氣成分類別及相對含量Table 3 Aroma categories and relative contents of different Chinese chestnuts cultivars

3 討論與結論

基于“相似相溶”的原理，不同材料的萃取頭對揮發性物質吸附具有選擇性。在參照以往研究的基礎上，采用更準確可靠的SPME-GC-MS 聯用技術對不同品種板栗果實的香氣成分進行研究，結果表明：使用色譜柱 HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）分析時，萃取頭 DVB/CAR/PDMS（50/30 μm）萃取到的香氣種類最多，因此，在后續試驗測定不同板栗品種的香氣成分時可選用，該方法可以快速準確地提取到板栗的多種香氣成分。

目前，國內外對板栗特征香氣成分尚無統一認識，丁內酯和2-羥基-γ-丁內酯這兩種內酯類物質具有愉快的水果香和堅果香，一般被認為是烤板栗的特征性香氣物質[5,20]。本研究發現，3 個生板栗品種（未加工處理）中均含有大量庚醛、1-己醇和3-戊烯-2-酮等果香味的成分；“大板紅”和“燕山早豐”中含有大量果香味的己醛；而具有甜香味的乙酸丁酯和乙酸己酯僅在“大板紅”中被檢出，并且相對含量很高。該分析結果為后續研究不同品種間板栗果實特征香氣組分分析和品質評價奠定了基礎。

本研究支持板栗品種間香氣成分種類和含量存在差異的觀點。“大板紅”板栗果實中己醛、3-戊烯-2-酮、乙酸己酯、庚醛、1-己醇為其主要香氣成分；“冀栗1 號”板栗果實中乙醛、3-戊烯-2-酮、庚醛、1-己醇、1-丁醇為主要香氣成分；“燕山早豐”板栗果實中己醛、3-戊烯-2-酮、庚醛、1-己醇、1-丁醇為主要香氣成分。這與草莓、杏、柑橘和獼猴桃上的研究一致[21-25]。同時，還在“大板紅”板栗果實中檢測出乙酸丁酯、乙酸己酯2 種酯類物質，這些成分的嗅覺閾值很低，其香氣值（濃度/閾值）很高[26]，對果實的香味也有重要影響，但在其他兩個板栗品種中均未檢測到這兩種物質，因此，乙酸丁酯和乙酸己酯有可能是“大板紅”板栗的特有香氣物質。“燕龍”板栗中丁內酯、糠醛和5-（羥甲基）-2-糠醛的含量較高[3]，王文艷等[20]研究發現板栗生粉中己醛和二氫-5-戊基-2（3H）-呋喃酮的含量很高。本研究中“大板紅”、“冀栗1 號”及“燕山早豐”3 個品種同時檢測到的芳香成分有10 種，各個品種果實中均含有3-戊烯-2-酮、庚醛、1-己醇、1-丁醇等重要的芳香成分，但相對含量存在差異。Krist 等[5]和 Morini 等[17]在板栗中檢測出 3-羥基-2-丁酮、甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪3 種物質，認為該3 種物質為烤板栗和煮板栗的主要香氣成分。葉興乾等[18]在糖炒板栗中有檢出2-戊基-呋喃，該物質具有果香、青香的香氣。本試驗雖然在“大板紅”和“冀栗1號”中也檢測到該物質，但相對含量很低，“燕山早豐”中沒有檢測出，可能跟板栗果實的加工處理方法有關。以上結果表明：板栗果實中香氣成分的種類及其相對含量的異同使不同品種果實既具有板栗果實基本的香味特征，又具有各自獨特的香味特點。為此，根據其特有的香氣成分，或可為品種或種群的劃分提供依據，具體方法有待進一步深入分析。