黃芪甲苷抑制胰腺癌PANC1細胞惡性生物學行為及其作用機制

蔡秀珍 張曼 劉濤

1濰坊市中醫院藥學部，濰坊 261041；2濰坊市腦科醫院藥劑科，濰坊 261021

【提要】 采用CCK8檢測胰腺癌PANC1細胞的存活率，劃痕實驗和Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力，蛋白質印跡法檢測與細胞增殖、凋亡及上皮間質轉化相關的蛋白表達等方法探討黃芪甲苷對胰腺癌PANC1細胞惡性生物學行為的影響。結果顯示，黃芪甲苷干預PANC1細胞后可抑制細胞的存活率，顯著減少遷移和穿膜的細胞數量，影響相關蛋白的表達，提示黃芪甲苷抑制胰腺癌PANC1細胞生長的機制可能與其抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡、抑制上皮間質轉化過程有關。

黃芪甲苷是中藥黃芪天然活性成分提取物之一，具有許多藥理作用，如抑制炎癥、抗氧化、降低血糖、調節脂肪及能量代謝、抗纖維化、調節免疫及抗腫瘤等[1-6]。早期研究發現，黃芪甲苷可以通過PKC-α-ERK1/2-NF-κB信號通路抑制肺癌細胞A549的遷移和侵襲[7]。然而黃芪甲苷是否對胰腺癌發揮同樣的抗腫瘤作用尚不明確。本研究探討黃芪甲苷對胰腺癌PANC1細胞的作用及其機制，為胰腺癌的治療提供新的策略。

一、材料與方法

1．PANC1細胞增殖活性檢測：胰腺癌PANC1細胞購自ATCC，常規復蘇并傳代。取對數生長期細胞，接種于96孔板，每孔3×105個細胞。培養過夜后將溶解于DMSO的終濃度為1、2.5、5、7.5 μg/ml的黃芪甲苷(成都科程生物科技開發公司)分別孵育細胞24、48、72、96 h，以單加DMSO作為對照組，每個實驗組設置6個復孔。培養到相應時間點，避光每孔加入10 μl CCK8(武漢博士德生物公司)，繼續孵育2 h，上酶標儀檢測每孔在450 nm處吸光度值(A450值)。篩選出合適的黃芪甲苷濃度進行后續實驗。

2．PANC1細胞遷移能力檢測：取對照組和黃芪甲苷組對數生長期PANC1細胞，分別以每孔3×105個細胞接種于6孔板，培養過夜后，用200 μl無菌槍頭劃痕，PBS輕輕沖洗后加入含合適濃度黃芪甲苷的培養液培養0、24 h，拍照計算遷移到痕跡空白處的細胞數。每組設置3個復孔，取均值。

3．PANC1細胞侵襲能力檢測：取對照組和黃芪甲苷組對數生長期PANC1細胞，接種1×106細胞/100 μl于隔膜鋪有基質膠的Transwell小室(美國BD公司)的上室，下室加500 μl培養液，培養孵育24 h后，取出小室隔膜，用棉簽輕輕擦去隔膜上室面未穿膜細胞，將隔膜置于4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，光鏡下計算高倍鏡下的穿膜細胞數。每組設置3個小室，取均值。

4．相關蛋白表達檢測：收集對照組和黃芪甲苷組培養48 h的細胞，加入適量的細胞裂解液(美國賽默飛公司)，冰上裂解30 min。離心取上清，應用BCA蛋白濃度測定試劑盒(Thermo公司)測定蛋白濃度。取30～40 μg蛋白，常規行蛋白質印跡法檢測評估腫瘤細胞增殖能力的蛋白PCNA[8]、細胞凋亡的效應蛋白caspase3[9]、上皮細胞標志物E-cadherin及間質細胞標志物N-cadherin、vimentin表達，以GAPDH為內參。所有一抗均購于英國Abcam公司，按相應抗體說明書推薦比例稀釋一抗。最后ECL發光，X片曝光、顯影、定影。以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

二、結果

1．黃芪甲苷抑制胰腺癌PANC1細胞的存活：與對照組比較，1 μg/ml黃芪甲苷組存活細胞數量差異無統計學意義(P>0.05)，2.5、5、7.5 μg/ml黃芪甲苷組的存活細胞數量呈劑量及時間依賴性地減少，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。5 μg/ml與7.5 μg/ml黃芪甲苷組的存活細胞數量在不同時間點差異均無統計學意義(P值均>0.05)，故選擇5 μg/ml黃芪甲苷組細胞進行后續實驗(圖1)。

2．黃芪甲苷抑制胰腺癌PANC1細胞增殖并誘導其凋亡：與對照組比較，黃芪甲苷組PCNA蛋白表達顯著下調(1.32±0.12比0.86±0.16，t=5.142，P=0.007，圖2A)，caspase3蛋白表達顯著上調(0.45±0.17比0.87±0.15，t=4.142，P=0.004，圖2B)，表明黃芪甲苷組胰腺癌PANC1細胞存活數量減少可能是由于黃芪甲苷抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡所引起。

3．黃芪甲苷抑制胰腺癌PANC1細胞的遷移和侵襲能力：劃痕實驗結果顯示，黃芪甲苷組的遷移細胞數量較對照組顯著減少(76.35±11.32比52.34±9.46，圖3A～3B)；穿膜細胞數量較對照組顯著減少(135.24±12.45比54.69±25.39，圖3C～3D)，差異均有統計學意義(t值分別為3.623、6.369，P值分別為0.022、0.003)，表明黃芪甲苷可抑制胰腺癌PANC1細胞的遷移和侵襲能力。

圖1 不同濃度黃芪甲苷對胰腺癌PANC1細胞增殖的影響

圖2 對照組(1)、黃芪甲苷組(2)PANC1細胞PCNA(2A)和caspase3(2B)蛋白表達

圖3 對照組、黃芪甲苷組的PANC1細胞遷移(3A～3B)和侵襲(3C～3D)能力

4．黃芪甲苷抑制胰腺癌PANC1細胞的上皮-間質轉化過程：與對照組比較，黃芪甲苷組E-cadherin表達上調(0.35±0.09比0.96±0.15)，N-cadherin(0.45±0.08比0.27±0.08)和vimentin(0.37±0.07比0.21±0.05)表達均下調(圖4)，差異均有統計學意義(t值分別為7.797、3.558、4.159，P值均<0.05)，提示黃芪甲苷可能通過抑制上皮間質轉化過程進而抑制胰腺癌PANC1的遷移和侵襲能力。

圖4 對照組(1)、黃芪甲苷組(2)PANC1細胞的上皮-間質轉化相關蛋白表達

討論早期胰腺癌首選手術治療，術后輔助進行化療，以控制潛在的腫瘤細胞微轉移[10-11]。有研究表明，5-氟尿嘧啶加亞葉酸或吉西他濱的輔助化療可將胰腺癌患者5年生存率提高到16%～21%[12]。然而，腫瘤的早期復發、轉移以及腫瘤耐藥等問題仍是胰腺癌臨床治療亟待解決的難題。近年來，從中藥中提取的單體在各種惡性腫瘤的治療及輔助治療的研究廣泛開展。目前有研究表明黃芪甲苷通過抑制AKT信號通路增強阿帕替尼對胃癌AGS細胞的抗腫瘤作用[13]，但黃芪甲苷對胰腺癌細胞的作用尚不清楚。

本研究應用黃芪甲苷處理胰腺癌PANC1細胞，結果顯示，黃芪甲苷處理后呈劑量和時間依賴性抑制PANC1細胞存活率，同時下調細胞PCNA蛋白表達，上調caspase3蛋白表達，表明黃芪甲苷不僅可以抑制細胞增殖，且能夠促進細胞凋亡的發生。此外，黃芪甲苷處理還能顯著減少遷移和穿膜的細胞數量，表明黃芪甲苷能抑制PANC1細胞的遷移及侵襲能力。

為深入研究黃芪甲苷的作用機制，本研究檢測了上皮-間質轉化相關蛋白表達的變化。結果顯示黃芪甲苷處理后PANC1細胞的E-cadherin表達上調，N-cadherin和vimentin表達均下調，提示黃芪甲苷可能通過抑制上皮-間質轉化過程進而抑制胰腺癌PANC1細胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，黃芪甲苷可顯著抑制胰腺癌PANC1細胞惡性生物學行為，從而抑制胰腺癌的發生發展，有望成為治療胰腺癌的新型藥物靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突