甲基化CpG結合蛋白2在胰腺癌及癌旁組織中的表達及臨床意義

謝雨婷 高軍

海軍軍醫大學第一附屬醫院消化內科，上海 200433

胰腺癌確診困難，80%以上的患者確診時已經是晚期，失去了手術治療的機會。如果想提高胰腺癌患者的生存率，就必須提高患者的早期診斷率，因此尋找早期診斷指標，并為生物靶向治療提供依據是胰腺癌研究的重點和難點[1-3]。DNA甲基化是影響基因活性的主要表觀遺傳因素[4]，抑癌基因啟動子高甲基化被認為是癌癥發生的重要原因[5]。基因組表型遺傳修飾主要包括遺傳物質DNA的甲基化修飾和核小體組蛋白修飾，結果是在DNA堿基不發生改變的情況下而表型卻發生了變化。甲基化CpG結合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2，MeCP2)是能與甲基化DNA結合的一類核蛋白，可以將DNA甲基化和組蛋白修飾耦合起來，在表觀遺傳中發揮著中樞紐帶的作用[6]。既往報道中，MeCP2與胃癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌、骨肉瘤等多種腫瘤的發生和發展相關[7-8]，但在胰腺癌中的研究欠缺。本研究應用組織芯片，采用免疫組織化學染色法檢測胰腺癌組織及其匹配的癌旁正常組織MeCP2的表達，分析MeCP2表達與胰腺癌病理參數及預后的相關性，為深入理解胰腺癌發生、發展提供新的思路。

材料與方法

一、MeCP2蛋白表達檢測

組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司(產品批號：HPan-Ade120Sur-01)，芯片有63份胰腺癌組織，57份癌旁正常胰腺組織。常規切片后采用免疫組織化學染色法檢測MeCP2蛋白表達。兔抗人MeCP2多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。將組織芯片切片常規脫蠟至水，并經檸檬酸鹽緩沖液煮沸進行抗原修復。經正常山羊血清封閉過夜后依次孵育MeCP2多克隆抗體和辣根過氧化酶標記的山羊抗兔二抗。以DAB為底物顯色后封片。選擇組織結構清晰且染色均勻的胰腺癌組織芯片進行結果分析。免疫組織化學結果由2位病理科醫師采用雙盲法獨立讀片，并進行評分。每張標本在高倍鏡下至少觀察3個視野，按陽性細胞比例和染色強度進行病理學評分。陽性細胞比例≤1%為0分，2%～25%為1分，26%～50%為 2分，51%～<75%為3分，≥75%為4分；無染色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞比例評分與染色強度評分的乘積作為病理學評分，<4分為陰性(-)，≥4分為陽性(+)[7]。

二、臨床資料

選擇胰腺組織結構清晰且染色均勻的胰腺癌及癌旁正常胰腺組織芯片，共59例胰腺癌和53例癌旁正常胰腺組織入組。按MeCP2表達情況將芯片組織分為MeCP2陽性組和MeCP2陰性組。59例胰腺癌患者年齡43～81歲，中位年齡62歲，手術時間2009年1月至2013年8月，術前均未接受放、化療或其他抗腫瘤輔助治療。隨訪時間截至2014年11月。總生存期定義為從患者手術治療日到患者死亡或者末次隨訪時間。患者死亡原因排除非胰腺癌的死亡。

三、統計學處理

結 果

一、胰腺癌及癌旁組織MeCP2表達及其與臨床病理特征的相關性

59例胰腺癌組織中28例MeCP2陽性表達，31例MeCP2陰性表達，陽性表達率為47.5%；53例癌旁組織中36例MeCP2陽性表達，17例MeCP2陰性表達，陽性表達率為67.9%(圖1)，癌旁組織的陽性表達率明顯高于胰腺癌組織，差異有統計學意義(χ2=4.776，P=0.029)。

圖1 胰腺癌組織(1A)及其癌旁組織(1B)中的MeCP2表達(免疫組織化學染色 ×100)

胰腺癌組織MeCP2陽性表達與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、神經侵犯、臨床分期均無顯著相關性，但有淋巴結轉移及病理Ⅲ級的胰腺癌組織MeCP2陽性表達例數明顯少于陰性表達例數，而無淋巴結轉移及病理Ⅱ級的胰腺癌組織MeCP2陽性表達例數明顯多于陰性表達例數，差異均有統計學意義(表1)。

癌旁組織MeCP2陽性表達與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結轉移、神經侵犯均無顯著相關性，但病理Ⅲ級胰腺癌的癌旁組織MeCP2陽性表達例數明顯少于陰性表達例數，而病理Ⅱ級的癌旁組織MeCP2陽性表達例數明顯多于陰性表達例數；臨床4期的癌旁組織MeCP2陽性表達例數少于陰性表達例數，而臨床2期的癌旁組織MeCP2陽性表達例數明顯多于陰性表達例數，差異均有統計學意義(表1)。

表1 胰腺癌及癌旁組織MeCP2表達與臨床病理參數的相關性(例)

二、胰腺癌患者的生存期及預后因素

胰腺癌組織MeCP2陰性、陽性表達患者的中位總生存期分別為8個月、10個月(95%CI7.125～10.875，圖2)；癌旁組織MeCP2陰性、陽性表達患者的中位總生存期分別為8個月、10個月(95%CI7.224～10.776，圖3)。無論是胰腺癌組織還是癌旁組織，MeCP2陽性表達患者的總生存期均顯著長于陰性表達患者，差異均有統計學意義(P值分別為0.027、0.036)。Cox單因素分析結果顯示，胰腺癌患者預后與胰腺癌及癌旁組織MeCP2的表達和病理分級相關，即胰腺癌組織MeCP2陽性表達患者的生存期較陰性表達患者明顯延長，癌旁組織MeCP2陽性表達患者的生存期較陰性表達患者明顯延長，病理Ⅱ級患者的生存期較病理Ⅲ級患者明顯延長，差異均有統計學意義；但胰腺癌預后與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結轉移與否、神經侵犯與否、臨床分期等因素無相關性(表2)。多因素分析結果顯示，MeCP2在胰腺癌組織中的表達是胰腺癌患者預后評估的獨立因素，陽性表達的患者預后較好(表3)。

圖2 胰腺癌組織MeCP2表達陽性組與陰性組的總體生存曲線

圖3 胰腺癌癌旁組織MeCP2表達陽性組與陰性組的總體生存曲線

表2 59例胰腺癌患者臨床病理參數與患者預后的單因素分析

表3 59例胰腺癌患者臨床病理參數與患者預后的多因素分析

討 論

DNA甲基化是一種重要且與轉錄沉默有關的表觀遺傳修飾[9]，其對于DNA的精確調控至關重要[4]。MeCP2是與DNA甲基化密切相關的蛋白，在DNA甲基化中起著非常重要的作用，其功能依賴于識別和結合甲基化DNA的能力[9]。MeCP2是包含DNA甲基結合域的基礎蛋白[10]，招募組蛋白脫乙酰基酶、甲基化酶等到甲基化DNA，從而導致轉錄抑制[11]。有研究表明MeCP2通過結合胰腺癌細胞的甲基化CpG島來抑制胰腺癌細胞LIN28A的表達，而LIN28A的表達異常與人類腫瘤的發生和發展有關[12]，提示MeCP2可能有抑癌效應。

既往研究證實，MeCP2是一種染色質結合蛋白，可介導轉錄調控，在大腦中含量很高[13]。Rett綜合征(RTT)是一種嚴重的進行性神經系統疾病，主要影響年輕女性，而MeCP2基因突變是經典RTT病例的最普遍原因[14]。MeCP2也與一些精神疾病相關，例如自閉癥和精神分裂癥[15]。現有研究發現MeCP2還與乳腺癌、結腸癌、前列腺癌等腫瘤的發生和發展密切相關[16]。本研究結果顯示，胰腺癌組織MeCP2陽性表達率明顯高于癌旁組織，胰腺癌組織和癌旁組織MeCP2陽性表達患者的生存期較陰性患者長，說明MeCP2陰性則胰腺癌的侵襲性更強；胰腺癌MeCP2陰性表達組的腫瘤病理分級更高，淋巴結轉移也更常見。這些結果進一步說明MeCP2表達陰性的，腫瘤細胞可能具有更強的侵襲性，但淋巴結轉移與侵襲性之間有無聯系，還需要更多的基礎和臨床研究進行驗證。在癌旁組織中，MeCP2表達陽性率與病理分級和臨床分期相關，與淋巴結轉移無相關性，原因可能與取材位置有關。生存分析顯示胰腺癌組織MeCP2表達水平與患者預后密切相關，且Cox模型顯示癌組織MeCP2低表達是胰腺癌患者預后的獨立危險因素。但在該模型中，淋巴結轉移這一臨床特征顯示與患者預后無相關性。預后是各種影響因素綜合作用的結果，淋巴結轉移雖然與疾病本身的嚴重程度、病理分級等有關系，但它只是腫瘤預后的影響因素之一，當然也限于此次研究的樣本量。

本研究具有兩個方面的局限性。首先，這項研究是一個小樣本量的回顧性研究，結果表明胰腺癌組織MeCP2高表達患者病理分級較低，癌旁組織中MeCP2高表達患者臨床分期較早，雖然這一結果具有一定的指導意義，但后續仍需增加樣本量，以便對此結論進行進一步驗證，同時需要結合前瞻性研究加以證實；其次，局限于當前的醫療檢查技術，胰腺癌淋巴結轉移早期診斷仍是世界難題，CT、PET-CT容易漏診，現有的腫瘤標志物又不能判斷淋巴結轉移與否，故在判別淋巴結轉移與否并進行分組時，可能與真實情況存在偏差。總之，MeCP2表達在胰腺癌發生和發展中的作用機制及其評估預后的價值仍不清楚，需要更多的基礎和臨床研究成果進行支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突